Abstract The spike (S) protein of SARS-CoV-2 has been observed in three distinct pre-fusion conformations: locked, closed and open. Of these, the function of the locked conformation remains poorly understood. Here we engineered a SARS-CoV-2 S protein construct “S-R/x3” to arrest SARS-CoV-2 spikes in the locked conformation by a disulfide bond. Using this construct we determined high-resolution structures confirming that the x3 disulfide bond has the ability to stabilize the otherwise transient locked conformations. Structural analyses reveal that wild-type SARS-CoV-2 spike can adopt two distinct locked-1 and locked-2 conformations. For the D614G spike, based on which all variants of concern were evolved, only the locked-2 conformation was observed. Analysis of the structures suggests that rigidified domain D in the locked conformations interacts with the hinge to domain C and thereby restrains RBD movement. Structural change in domain D correlates with spike conformational change. We propose that the locked-1 and locked-2 conformations of S are present in the acidic high-lipid cellular compartments during virus assembly and egress. In this model, release of the virion into the neutral pH extracellular space would favour transition to the closed or open conformations. The dynamics of this transition can be altered by mutations that modulate domain D structure, as is the case for the D614G mutation, leading to changes in viral fitness. The S-R/x3 construct provides a tool for the further structural and functional characterization of the locked conformations of S, as well as how sequence changes might alter S assembly and regulation of receptor binding domain dynamics.

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) spike (S) protein continues to evolve antigenically, impacting antibody immunity. D1F6, an affinity-matured non-stereotypic VH1-2 antibody isolated from a patient infected with the SARS-CoV-2 ancestral strain, effectively neutralizes most Omicron variants tested, including XBB.1.5. We identify that D1F6 in the immunoglobulin G (IgG) form is able to overcome the effect of most Omicron mutations through its avidity-enhanced multivalent S-trimer binding. Cryo-electron microscopy (cryo-EM) and biochemical analyses show that three simultaneous epitope mutations are generally needed to substantially disrupt the multivalent S-trimer binding by D1F6 IgG. Antigenic mutations at spike positions 346, 444, and 445, which appeared in the latest variants, have little effect on D1F6 binding individually. However, these mutations are able to act synergistically with earlier Omicron mutations to impair neutralization by affecting the interaction between D1F6 IgG and the S-trimer. These results provide insight into the mechanism by which accumulated antigenic mutations facilitate evasion of affinity-matured antibodies.

Continued evolution of SARS-CoV-2 generates variants to challenge antibody immunity established by infection and vaccination. A connection between population immunity and genesis of virus variants has long been suggested but its molecular basis remains poorly understood. Here, we identify a class of SARS-CoV-2 neutralising public antibodies defined by their shared usage of VL6-57 light chains. Although heavy chains of diverse genotypes are utilized, convergent HCDR3 rearrangements have been observed among these public antibodies to cooperate with germline VL6-57 LCDRs to target a convergent epitope defined by RBD residues S371-S373-S375. Antibody repertoire analysis identifies that this class of VL6-57 antibodies is present in SARS-CoV-2-naive individuals and is clonally expanded in most COVID-19 patients. We confirm that Omicron specific substitutions at S371, S373 and S375 mediate escape of antibodies of the VL6-57 class. These findings support that this class of public antibodies constitutes immune pressure promoting the introduction of S371L/F-S373P-S375F in Omicron variants. The results provide further molecular evidences to support that antigenic evolution of SARS-CoV-2 is driven by antibody mediated population immunity.

Abstract SARS-CoV-2 spike protein (S) is structurally dynamic and has been observed by cryo-EM to adopt a variety of prefusion conformations that can be categorized as locked, closed and open. The locked conformations feature tightly packed trimers with structural elements incompatible with RBD in “up” position. For SARS-CoV-2 S, it has been shown that the locked conformations are transient under neutral pH. Probably due to their transience, locked conformations remain largely uncharacterized for SARS-CoV-1 S. Intriguingly, locked conformations were the only conformations captured for S proteins of bat and pangolin origin SARS-related coronaviruses. In this study, we introduced x1, x2, and x3 disulfides into SARS-CoV-1 S. Some of these disulfides have been shown to preserve rare locked conformations when introduced to SARS-CoV-2 S. Introduction of these disulfides allowed us to image a variety of locked and other rare conformations for SARS-CoV-1 S by cryo-EM. We identified bound cofactors and structural features that are associated with SARS-CoV-1 S locked conformations. We compare newly determined structures to other available spike structures of Sarbecoviruses to identify conserved features and discuss their possible functions.