Activated effector T (TE) cells augment anabolic pathways of metabolism, such as aerobic glycolysis, while memory T (TM) cells engage catabolic pathways, like fatty acid oxidation (FAO). However, signals that drive these differences remain unclear. Mitochondria are metabolic organelles that actively transform their ultrastructure. Therefore, we questioned whether mitochondrial dynamics controls T cell metabolism. We show that TE cells have punctate mitochondria, while TM cells maintain fused networks. The fusion protein Opa1 is required for TM, but not TE cells after infection, and enforcing fusion in TE cells imposes TM cell characteristics and enhances antitumor function. Our data suggest that, by altering cristae morphology, fusion in TM cells configures electron transport chain (ETC) complex associations favoring oxidative phosphorylation (OXPHOS) and FAO, while fission in TE cells leads to cristae expansion, reducing ETC efficiency and promoting aerobic glycolysis. Thus, mitochondrial remodeling is a signaling mechanism that instructs T cell metabolic programming.

Schistosoma mansoni cercariae penetrate the skin by releasing excretory/secretory (E/S) products known as 0-3hRP, which are associated with immune modulation through Toll like receptor (TLR) signalling. Furthermore, these secretions contain Sm16, which when given to cells as a recombinant protein inhibits human monocyte derived cytokine responses to TLR4 and TLR3 ligands. Nonetheless, the extent and mechanism(s) of these inhibitory effects remain largely uncharacterized. Murine bone marrow derived macrophages were exposed to different fractions of 0-3hRP, obtained via ultracentrifugation, or recombinant Sm16. These cells were exposed to the parasite molecules in combination with different TLR ligands, or Interferon gamma, and tested for the production of the cytokines IL-10 and IL-12p40, and their ability to process antigen. The immunomodulatory function of 0-3hRP is enriched predominantly in the pellet fraction, which contains a greater proportion of Sm16, also corroborating the ability of recombinant Sm16 to inhibit macrophage activation in response to TLR ligands. We further demonstrate that Sm16 blocks classical activation of macrophages to LPS or IFN-γ stimulation in vitro, and that inhibition of macrophage classical activation is independent of TLR2 recognition. Finally we show that Sm16 shares the altered intracellular processing observed for 0-3hRP, and is able to delay antigen processing by macrophages. Collectively, our findings show that Sm16 is a major component of S. mansoni cercarial E/S products, and is partly responsible for its immune-regulatory properties. Moreover, we propose that the mechanism employed by Sm16 to exert its inhibitory function is likely to be linked with alteration of endosomal trafficking and is not dependent on particular TLR receptors. Finally, we suggest that accumulation of Sm16 in the skin after percutaneous infection with S. mansoni cercariae could contribute to limiting dermal inflammation.

Abstract Immune checkpoint blockade (ICB) has significantly improved the prognosis of cancer patients, but the majority experience limited benefit, evidencing the need for new therapeutic approaches. Upregulation of sialic acid-containing glycans, termed hypersialylation, is a common feature of cancer-associated glycosylation, driving disease progression and immune escape via the engagement of Siglec-receptors on tumor-infiltrating immune cells. Here, we show that tumor sialylation correlates with distinct immune states and reduced survival in human cancers. The targeted removal of Siglec-ligands in the tumor microenvironment, using an antibody-sialidase conjugate, enhances anti-tumor immunity and halts tumor progression in several mouse tumor models. Using single-cell RNA sequencing, we reveal desialylation mechanistically to repolarize tumor-associated macrophages (TAMs) and identify Siglec-E on TAMs as the main receptor for hypersialylation. Finally, we show genetic and therapeutic desialylation, as well as loss of Siglec-E, to synergize with ICB. Thus, therapeutic desialylation represents a novel immunotherapeutic approach, shaping macrophage phenotypes and augmenting the adaptive anti-tumor immune response.

Abstract Fatty acid oxidation (FAO) is upregulated in IL-4-stimulated (alternatively activated) macrophages (M(IL-4)). We examined the effect of loss of function of the enzyme Cpt1a, which facilitates the entry of long chain fatty acids (FA) into mitochondria for FAO, on alternative activation. Expression of M(IL-4) markers ARG1, CD301 and RELMα, was impaired in tamoxifen-treated ERT2Cre x Cpt1a fl/fl macrophages and in macrophages expressing shRNA targeting Cpt1a (Cpt1a- shRNA). In contrast, Vavi Cre x Cpt1a fl/fl and Lysm Cre x Cpt1a fl/fl M(IL-4) responded normally to IL-4. Reduced alternative activation due to Cpt1a loss of function was linked to decreased cellular pools of α-ketoglutarate, glutamate, and glutathione, diminished commitment of glucose carbon to serine/glycine synthesis, and decreased expression of genes in the Nrf2-oxidative stress response pathway. Consistent with this, reactive oxygen species were increased. Restoration of glutathione pools with N-acetyl cysteine normalized oxidative stress and allowed alternative activation in the face of Cpt1a -deficiency, pointing to a role for FAO in the control of ROS and as being important for alternative activation. In Vavi Cre x Cpt1a fl/fl M(IL-4), glutamine uptake was increased, compensating for the loss of FAO to meet necessary metabolic demands, to allow alternative activation. The data indicate that macrophages are able to regulate glutamine metabolism to compensate for chronic disruption of FAO to meet metabolic needs.

Abstract Macrophages populate every organ during homeostasis and disease, displaying features of tissue imprinting and heterogeneous activation. The disjointed picture of macrophage biology that emerged from these observations are a barrier for integration across models or with in vitro macrophage activation paradigms. We set out to contextualize macrophage heterogeneity across mouse tissues and inflammatory conditions, specifically aiming to define a common framework of macrophage activation. We built a predictive model with which we mapped the activation of macrophages across 12 tissues and 25 biological conditions, finding a striking commonality and finite number of transcriptional profiles, which we modelled as defined stages along four conserved activation paths. We verified this model with adoptive cell transfer experiments and identified transient RELMɑ expression as a feature of macrophage tissue engraftment. We propose that this integrative approach of macrophage classification allows the establishment of a common predictive framework of macrophage activation in inflammation and homeostasis. One Sentence Summary We propose an integrative approach of macrophage classification that allows the establishment of a common framework of macrophage activation in inflammation and homeostasis.

Abstract Little is known about the effects of high fat diet (HFD)-induced obesity on resident colonic lamina propria (LP) macrophages (LPMs) function and metabolism. Here, we report that obesity and diabetes resulted in increased macrophage infiltration in the colon. These macrophages exhibited the residency phenotype CX3CR1 hi MHCII hi , and were CD4 − TIM4 − . During HFD, resident colonic LPM exhibited a lipid metabolism gene expression signature that overlapped that used to define lipid associated macrophages (LAMs). Via single cell RNA sequencing, we identified a sub-cluster of macrophages, increased in HDF, that were responsible for the LAM signature. Compared to other macrophages in the colon, these cells were characterized by elevated glycolysis, phagocytosis and efferocytosis signatures. CX3CR1 hi MHCII hi colonic resident LPMs had fewer lipid droplets (LD) and decreased triacylglycerol (TAG) content compared to equivalent cells in lean mice, and exhibited increased phagocytic capacity, suggesting that HFD induces adaptive responses in LPMs to limit bacterial translocation.

Macrophages are integral to most tissues. Foam cells, macrophages with lipid droplets (LDs) which are stores of triacylglycerols (TGs) and cholesterol esters (CEs), are found in various disease states. LDs can act as energy stores since TG lipolysis releases fatty acids (FAs) for mitochondrial oxidation (FAO), a process that relies on long-chain FA conversion into acylcarnitines by the enzyme Cpt1a. However, in macrophages, proinflammatory signals result in diminished FAO and increased TG synthesis with LD development. We explored the significance of LDs in cells that do not utilize FAO. We show that macrophages stimulated with lipopolysaccharide (LPS) plus interferon-g (IFNg) accumulate TGs in LDs, and long-chain acylcarnitines. In these cells, inhibition of TG synthesis results in diminished LD development, and increased long chain acylcarnitine levels, suggesting that FA fate is balanced between TG and acylcarnitine synthesis. Nevertheless, TG-synthesis is required for inflammatory macrophage function, since its inhibition negatively affects production of proinflammatory IL-1b, IL-6 and PGE2, and phagocytic capacity, and protects against LPS-induced shock in vivo. Failure to make PGE2 is critical for this phenotype, since exogenous PGE2 reverses the anti-inflammatory effects of TG-synthesis inhibition. These findings place LDs in a position of central functional importance in inflammatory macrophages.

Abstract Immune cells must adapt to different environments during the course of an immune response. We studied the adaptation of CD8 + T cells to the intestinal microenvironment and how this process shapes their residency in the gut. CD8 + T cells progressively remodel their transcriptome and surface phenotype as they acquire gut residency, and downregulate expression of mitochondrial genes. Human and mouse gut-resident CD8 + T cells have reduced mitochondrial mass, but maintain a viable energy balance to sustain their function. We found that the intestinal microenvironment is rich in prostaglandin E 2 (PGE 2 ), which drives mitochondrial depolarization in CD8 + T cells. Consequently, these cells engage autophagy to clear depolarized mitochondria, and enhance glutathione synthesis to scavenge reactive oxygen species (ROS) that result from mitochondrial depolarization. Impairing PGE 2 sensing promotes CD8 + T cell accumulation in the gut, while tampering with autophagy and glutathione negatively impacts the T cell population. Thus, a PGE 2 -autophagy-glutathione axis defines the metabolic adaptation of CD8 + T cells to the intestinal microenvironment, to ultimately influence the T cell pool.

We report here a central role for polyamines in T cell differentiation and function. Deficiency in ornithine decarboxylase (ODC), a critical enzyme for polyamine synthesis, resulted in a profound failure of CD4+ T cells to adopt correct subset specification, underscored by ectopic expression of multiple cytokines and lineage-defining transcription factors across TH1, TH2, TH17, and Treg polarizing conditions, and enhanced colitogenic potential. T cells deficient in deoxyhypusine synthase (DHPS) or deoxyhypusine hydroxylase (DOHH), which sequentially utilize polyamines to generate hypusine, phenocopied Odc -deficient T cells, and mice in which T cells lacked Dhps or Dohh developed colitis. Polyamine-hypusine pathway enzyme deficiency caused widespread chromatin and transcriptional dysregulation accompanied by alterations in histone methylation, histone acetylation, and TCA cycle metabolites. Epigenetic modulation by 2-hydroxyglutarate, or histone acetyltransferase inhibition, restored CD4+ T cell subset specification. Thus, polyamine synthesis via hypusine is critical for maintaining the epigenome to focus TH cell subset fidelity.

Enrichment of tumor-associated macrophages (TAMΦs) in the tumor microenvironment correlates with worse clinical outcomes in triple-negative breast cancer (TNBC) patients, prompting the development of therapies to inhibit TAMΦ infiltration. However, the lackluster efficacy of CCL2-based chemotaxis blockade in clinical trials suggests that a new understanding of monocyte/macrophage infiltration may be necessary. Here we demonstrate that random migration, and not only chemotaxis, drives macrophage tumor infiltration. We identified tumor- associated monocytes (TAMos) that display a dramatically enhanced migration capability, induced rapidly by the tumor microenvironment, that drives effective tumor infiltration, in contrast to low-motility differentiated macrophages. TAMo, not TAMΦ, promotes cancer cell proliferation through activation of the MAPK pathway. IL-6 secreted both by cancer cells and TAMo themselves enhances TAMo migration by increasing dendritic protrusion dynamics and myosin- based contractility via the JAK2/STAT3 signaling pathway. Independent from CCL2 mediated chemotaxis, IL-6 driven enhanced migration and pro-proliferative effect of TAMo were validated in a syngeneic TNBC mouse model. Depletion of IL-6 in cancer cells significantly attenuated monocyte infiltration and reversed TAMo-induced cancer cell proliferation. This work reveals the critical role random migration plays in monocyte driven TAMΦ enrichment in a tumor and pinpoints IL-6 as a potential therapeutic target in combination with CCL2 to ameliorate current strategies against TAMΦ infiltration.