Two newly discovered immune modulators, chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus (CHIPS) and staphylococcal complement inhibitor (SCIN), cluster on the conserved 3' end of beta-hemolysin (hlb)-converting bacteriophages (betaC-phis). Since these betaC-phis also carry the genes for the immune evasion molecules staphylokinase (sak) and enterotoxin A (sea), this 8-kb region at the 3' end of betaC-phi represents an innate immune evasion cluster (IEC). By PCR and Southern analyses of 85 clinical Staphylococcus aureus strains and 5 classical laboratory strains, we show that 90% of S. aureus strains carry a betaC-phi with an IEC. Seven IEC variants were discovered, carrying different combinations of chp, sak, or sea (or sep), always in the same 5'-to-3' orientation and on the 3' end of a betaC-phi. From most IEC variants we could isolate active bacteriophages by mitomycin C treatment, of which lysogens were generated in S. aureus R5 (broad phage host). All IEC-carrying bacteriophages integrated into hlb, as was measured by Southern blotting of R5 lysogens. Large quantities of the different bacteriophages were obtained by mitomycin C treatment of the lysogens, and bacteriophages were collected and used to reinfect all lysogenic R5 strains. In total, five lytic families were found. Furthermore, phage DNA was isolated and digested with EcoR1, revealing that one IEC variant can be found on different betaI-phis. In conclusion, the four human-specific innate immune modulators SCIN, CHIPS, SAK, and SEA form an IEC that is easily transferred among S. aureus strains by a diverse group of beta-hemolysin-converting bacteriophages.

Leukocyte migration is a key event both in host defense against invading pathogens as well as in inflammation. Bacteria generate chemoattractants primarily by excretion (formylated peptides), complement activation (C5a), and subsequently through activation of leukocytes (e.g., leukotriene B4, platelet-activating factor, and interleukin 8). Here we describe a new protein secreted by Staphylococcus aureus that specifically impairs the response of neutrophils and monocytes to formylated peptides and C5a. This chemotaxis inhibitory protein of S. aureus (CHIPS) is a 14.1-kD protein encoded on a bacteriophage and is found in >60% of clinical isolates. CHIPS reduces the neutrophil recruitment toward C5a in a mouse peritonitis model, even though its activity is much more potent on human than on mouse cells. These findings suggest a new immune escape mechanism of S. aureus and put forward CHIPS as a potential new antiinflammatory therapeutic compound.

Abstract Implant-associated Staphylococcus aureus infections are difficult to treat because of biofilm formation. Bacteria in a biofilm are often insensitive to antibiotics and host immunity. Monoclonal antibodies (mAbs) could provide an alternative approach to improve the diagnosis and/or treatment of biofilm-related infections. Here we show that mAbs targeting common surface components of S. aureus can recognize clinically relevant biofilm types. We identify two groups of antibodies: one group that uniquely binds S. aureus in biofilm state and one that recognizes S. aureus in both biofilm and planktonic state. In a mouse model, we show that mAb 4497 (recognizing wall teichoic acid (WTA)) specifically localizes to biofilm-infected implants. In conclusion, we demonstrate the capacity of several human mAbs to detect S. aureus biofilms in vitro and in vivo . This is an important first step to develop mAbs for imaging or treating S. aureus biofilms.

Abstract IgG molecules are essential players in the human immune response against bacterial infections. An important effector of IgG-dependent immunity is the induction of complement activation, a reaction that triggers a variety of responses that help to kill bacteria. Antibody-dependent complement activation is promoted by the organization of target-bound IgGs into hexamers that are held together via noncovalent Fc-Fc interactions. Here we show that Staphylococcal protein A (SpA), an important virulence factor and vaccine candidate of Staphylococcus aureus , effectively blocks IgG hexamerization and subsequent complement activation. Using native mass spectrometry and high-speed atomic force microscopy, we demonstrate that SpA blocks IgG hexamerization through competitive binding to the Fc-Fc interaction interface on IgG monomers. In concordance, we show that SpA interferes with the formation of (IgG) 6 :C1q complexes and prevents downstream complement activation on the surface of S. aureus. Lastly, we demonstrate that IgG3 antibodies against S. aureus can potently induce complement activation even in the presence of SpA. Altogether, this study identifies SpA as an immune evasion protein that specifically blocks IgG hexamerization.

Abstract Complement is an important effector mechanism for antibody-mediated clearance of infections and tumor cells. Upon binding to target cells, the antibody’s constant (Fc) domain recruits complement component C1 to initiate a proteolytic cascade that generates lytic pores and stimulates phagocytosis. The C1 complex (C1qr 2 s 2 ) consists of the large recognition protein C1q and a heterotetramer of proteases C1r and C1s (C1r 2 s 2 ). While interactions between C1 and IgG-Fc’s are believed to be mediated by the globular heads of C1q, we here find that C1r 2 s 2 proteases affect the capacity of C1q to form an avid complex with surface-bound IgG molecules (on various DNP-coated surfaces and pathogenic Staphylococcus aureus ). The extent to which C1r 2 s 2 contribute to C1q-IgG stability strongly differs between human IgG subclasses. Using antibody engineering of monoclonal IgG we reveal that hexamer-enhancing mutations improve C1q-IgG stability, both in absence and presence of C1r 2 s 2 . In addition, hexamer-enhanced IgGs targeting S. aureus mediate improved complement-dependent phagocytosis by human neutrophils. Altogether, these molecular insights into complement binding to surface-bound IgGs could be important for optimal design of antibody therapies.

Abstract Immunoglobulin G molecules are crucial for the human immune response against bacterial infections. IgGs can trigger phagocytosis by innate immune cells, like neutrophils. To do so, IgGs should bind to the bacterial surface via their variable Fab regions and interact with Fcγ receptors (FcγRs) and complement C1 via the constant Fc domain. C1 binding to IgG-labeled bacteria activates the complement cascade, which results in bacterial decoration with C3-derived molecules that are recognized by complement receptors (CRs) on neutrophils. Next to FcγRs and CRs on the membrane, neutrophils also express the intracellular neonatal Fc receptor (FcRn). We previously reported that staphylococcal protein A (SpA), a key immune evasion protein of Staphylococcus aureus , potently blocks IgG-mediated complement activation and killing of S. aureus by interfering with IgG hexamer formation. SpA is also known to block IgG-mediated phagocytosis in absence of complement but the mechanism behind it remains unclear. Here we demonstrate that SpA blocks IgG-mediated phagocytosis and killing of S. aureus through inhibition of the interaction of IgGs with FcγRs (FcγRIIa and FcγRIIIb, but not FcγRI) and FcRn. Furthermore, our data show that multiple SpA domains are needed to effectively block IgG1-mediated phagocytosis. This provides a rationale for the fact that SpA from S. aureus contains four to five repeats. Taken together, our study elucidates the molecular mechanism by which SpA blocks IgG-mediated phagocytosis and supports the idea that next to FcγRs, also the intracellular FcRn receptor is essential for efficient phagocytosis and killing of bacteria by neutrophils.

Bacterial pathogens have evolved to secrete strong anti-inflammatory proteins that target the immune system. It was long speculated whether these virulence factors could serve as therapeutics in diseases in which abnormal immune activation plays a role. We adopted the secreted Chemotaxis Inhibitory Protein of Staphylococcus aureus (CHIPS) as a model virulence factor-based therapeutic agent for diseases in which C5aR1 stimulation plays an important role. We show that administration of CHIPS in human C5aR1 knock-in mice successfully dampens C5a mediated neutrophil migration during immune complex-initiated inflammation. Subsequent CHIPS toxicology studies in animal models were promising. However, during a small phase-I trial, healthy human volunteers showed adverse effects directly after CHIPS administration. Subjects showed clinical signs of anaphylaxis with mild leukocytopenia and increased C-reactive protein concentrations, suggesting an inflammatory response, which are believed to be related to the presence of relatively high circulating anti-CHIPS antibodies. Even though our data in mice shows CHIPS as a potential anti-inflammatory agent, safety issues in human subjects temper the use of CHIPS in its current form as a therapeutic candidate. The use of staphylococcal proteins, or other bacterial proteins, as therapeutics or immune-modulators in humans is severely hampered by pre-existing circulating antibodies.

Staphylococcal Superantigen-Like (SSL) proteins, one of major virulence factor families produced by Staphylococcus aureus, were previously demonstrated to be immune evasion molecules that interfere with a variety of innate immune defenses. However, in contrast to these characterized SSLs, that inhibit immune functions, we show that SSL13 is a strong activator of neutrophils via the formyl-peptide receptor 2 (FPR2). Moreover, our data show that SSL13 acts as a chemoattractant, induces degranulation and oxidative burst in neutrophils. As with many other staphylococcal immune evasion proteins, SSL13 shows a high degree of human specificity. SSL13 is not able to efficiently activate mouse neutrophils, hampering in vivo experiments. In conclusion, SSL13 is a neutrophil chemoattractant and activator that acts via the FPR2. Therefore, SSL13 is a unique SSL member that does not belong to the immune evasion class, but is a pathogen alarming molecule.