Abstract Enhancing yield during bacterial enzyme production could have positive economic and environmental impacts. For cell factories, such improvements in yields could potentially be obtained by fine-tuning the metabolic processes and their regulatory mechanisms for gene candidates. In pursuit of such candidates, we performed RNA-sequencing of two α -amylase producing Bacillus strains and predict hundreds of putative novel non-coding transcribed regions. Complex operons that are regulated by a wide variety of transcription factors, non-coding and structured RNAs add to the challenge of finding yield-affecting candidates. Surprisingly, we found that non-coding genomic regions are proportionally undergoing the highest changes in expression during fermentation (75% of novel RNA predictions had absolute logFC > 2). Since these classes of RNA are also understudied, we targeted the corresponding genomic regions with CRIPSRi knockdown to test for any potential impact on the yield. From differentially expressed annotations, including both novel candidate and prior annotated ncRNAs, we selected 53 non-coding candidates. The targeting with CRISPRi knockdowns transcription in a genomic region on both the sense and the antisense strand. Thus, the CRISPRi experiment cannot link causes for yield changes to the sense or antisense disruption. Nevertheless, we observed on several instances with strong changes in enzyme yield. The knockdown targeting the genomic region for a putative antisense RNA of the 3’ UTR of the skfA-skfH operon led to a 21% increase in yield. In contrast, the knockdown targeting the genomic regions of putative antisense RNAs of the cytochrome c oxidase subunit 1 ( ctaD ), the sigma factor sigH , and the uncharacterized gene yhfT decreased yields by 31 to 43%.

Abstract The production of the alpha-amylase (AMY) enzyme in Bacillus subtilis at a high rate leads to the accumulation of unfolded AMY, which causes secretion stress. The over-expression of the PrsA chaperone aids the enzyme folding and reduces stress. To identify affected pathways and potential mechanisms involved in the reduced growth, we analyzed the transcriptomic differences during fed-batch fermentation between a PrsA over-expressing strain and a control in a time-series RNA-seq experiment. We observe transcription in 542 previously un-annotated regions, of which 234 had significant changes in expression levels between the samples. Moreover, 1,791 protein-coding sequences, 80 non-coding genes, and 20 riboswitches overlapping UTR regions of coding genes had significant changes in expression. Via gene-set over-representation analysis of the differentially expressed genes, we identified putatively regulated biological processes; overall the analysis suggests that the PrsA over-expression affects ATP biosynthesis activity, amino acid metabolism, and cell wall stability. The investigation of the protein interaction network points to a potential impact on cell motility signaling. We discuss the impact of these highlighted mechanisms for reducing secretion stress or detrimental aspects of PrsA over-expression during AMY production.

SUMMARY mRNA secondary structure influences translation. Proteins that modulate the mRNA secondary structure around the translation initiation region may regulate translation in plastids. To test this hypothesis, we exposed Arabidopsis thaliana to high light, which induces translation of psbA mRNA encoding the D1 subunit of photosystem II. We assayed translation by ribosome profiling and applied two complementary methods to analyze in vivo RNA secondary structure: DMS-MaPseq and SHAPE-seq. We detected increased accessibility of the translation initiation region of psbA after high light treatment, likely contributing to the observed increase in translation by facilitating translation initiation. Furthermore, we identified the footprint of a putative regulatory protein in the 5’ UTR of psbA at a position where occlusion of the nucleotide sequence would cause the structure of the translation initiation region to open up, thereby facilitating ribosome access. Moreover, we show that other plastid genes with weak Shine-Dalgarno sequences (SD) are likely to exhibit psbA -like regulation, while those with strong SDs do not. This supports the idea that changes in mRNA secondary structure might represent a general mechanism for translational regulation of psbA and other plastid genes. SIGNIFICANCE RNA structure changes in the translation initiation region, most likely as a result of protein binding, affect the translation of psbA and possibly other plastid genes with weak Shine-Dalgarno sequences.

The genome of Bacillus subtilis continues to provide exiting genomic insights. However, the growing collective genomic knowledge about this micro-organism is spread across multiple annotation resources. Thus, the full annotation is not directly accessible neither for specific genes nor for large-scale high-throughput analyses. Furthermore, access to annotation of non-coding RNA genes (ncRNAs) and polycistronic mRNAs is difficult. To address these challenges we introduce the Bacillus subtilis genome atlas, BSGatlas, in which we integrate and unify multiple existing annotation resources. Our integration provides twice as many ncRNAs than the individual resources, improves the positional annotation for 70% of the combined ncRNAs, and makes it possible to infer specific ncRNA types. Moreover, we unify known transcription start sites, termination, and transcriptional units (TUs) as a comprehensive transcript map. This transcript map implies 815 new TUs and 6,164 untranslated regions (UTRs), which is a five-fold increase over existing resources. We furthermore, find 2,309 operons covering the transcriptional annotation for 93% of all genes, corresponding to an improvement by 11%. The BSGatlas is available in multiple formats. A user can either download the entire annotation in the standardized GFF3 format, which is compatible with most bioinformatics tools for omics and high-throughput studies, or view the annotation in an online browser at http://rth.dk/resources/bsgatlas.