Abstract CCCH zinc finger proteins (ZFPs) function mainly as RNA-binding proteins (RBPs) where they play a central role in the mRNA metabolism. Over 27 CCCH-ZFPs are encoded in the genome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum , the causative agent of malaria tropica. However, little is known about their functions. In this study, we characterize one member of the PfCCCH-ZFP named ZNF4. We show that ZNF4 is highly expressed in mature gametocytes where it predominantly localizes to the cytoplasm. Targeted gene disruption of ZNF4 showed no significant effect in asexual blood stage replication and gametocyte development while male gametocyte exflagellation was significantly impaired leading to reduced malaria transmission in the mosquito. Comparative transcriptomics between wildtype (WT) and the ZNF4-deficient line (ZNF4-KO) demonstrated the de-regulation of about 473 genes (274-upregulated and 199 down-regulated) in mature gametocytes. Most of the down-regulated genes show peak expression in mature gametocyte with male enriched genes associated to the axonemal dynein complex formation and cell projection organization highly affected, pointing to the phenotype in male gametocyte exflagellation. Up-regulated genes are associated to ATP synthesis. Our combine data therefore indicate that ZNF4 is a CCCH zinc finger protein which plays an important role in male gametocyte exflagellation through the regulation of male gametocyte enriched genes. Author Summary CCCH ZFPs have gained significant interest due to their ability to interact with RNA and control different RNA metabolic processes. The role of CCCH ZFPs in the malaria parasite Plasmodium falciparum has not been well studied. In this study we report the functional characterization of a PfCCCH-ZFP named ZNF4. Using mouse anti-ZNF4 antisera and a ZNF4-HA tag parasite line we show that the protein is mainly expressed in the cytosol of mature gametocytes. To determine the function of ZNF4, we generated a ZNF4 knockout parasite line and we found that the asexual blood stages and gametocytes developed normally while the ability of the male gametocytes to exflagellate as well as the further development of the parasite in the mosquito was significantly impaired. Interestingly, when the transcriptome of mature gametocytes of the ZNF4-KO was compared to the WT, down-regulated genes were mainly male gametocyte enriched genes associated to processes involved in gametocyte exflagellation such axonemal dynein complex formation and cell projection organization indicating that ZNF4 plays an important role in male gametocyte exflagellation through the regulation of male gametocyte enriched transcripts.

Abstract Malaria transmission to mosquitoes is dependent on the formation of gametocytes. When fully matured, gametocytes are able to transform into gametes in the mosquito’s midgut, a process accompanied with their egress from the enveloping erythrocyte. Gametocyte maturation and gametogenesis require a well-coordinated gene expression programme that involves a wide spectrum of regulatory proteins, ranging from histone modifiers to transcription factors to RNA-binding proteins. Here, we investigated the role of the CCCH-zinc finger protein MD3 in P. falciparum gametocytogenesis. MD3 was originally identified by us as an epigenetically regulated protein of immature gametocytes and recently shown to be involved in male development in a barcode-based screen in P. berghei . We here show that MD3 is mainly present in the cytoplasm of immature male P. falciparum gametocytes. Parasites deficient of MD3 are impaired in gametocyte maturation and male gametocyte exflagellation. BioID analysis in combination with co-immunoprecipitation assays unveiled an interaction network of MD3 with RNA-binding proteins like PABP1 and ALBA3, with translational initiators, regulators and repressors like elF4G, PUF1, NOT1 and CITH, and with other regulators of gametocytogenesis, including ZNF4, MD1 and GD1. We conclude that MD3 is part of a regulator complex crucial for post-transcriptional fine-tuning of male gametocytogenesis.

Abstract Some proteins have acquired both ubiquitin ligase activity and RNA-binding properties and are therefore known as RNA-binding Ubiquitin ligases (RBULs). These proteins provide a link between the RNA metabolism and the ubiquitin proteasome system (UPS). The UPS is a crucial protein surveillance system of eukaryotes primarily involved in the selective proteolysis of proteins which are covalently marked with ubiquitin through a series of steps involving ubiquitin E1 activating, E2 conjugating and E3 ligating enzymes. The UPS also regulates other key cellular processes such as cell cycle, proliferation, cell differentiation, transcription and signal transduction. While RBULs have been characterized in other organisms, little is known about their role in Plasmodium falciparum , the causative agent of the deadliest human malaria, malaria tropica. In this study, we characterized a previously identified putative P. falciparum RING finger E3 ligase Pf RNF1. We show that the protein is highly expressed in sexual stage parasites and mainly present in immature male gametocytes. Using proximity interaction studies with parasite lines expressing Pf RNF1 tagged with the Biotin ligase BirA, we identified an interaction network of Pf RNF1 in both the asexual blood stages and gametocytes composed mainly of ribosomal proteins, RNA-binding proteins including translational repressors such DOZI, CITH, PUF1 and members of the CCR4-NOT complex, as well as proteins of the UPS such as RPN11, RPT1 and RPT6. Our interaction network analysis reveals Pf RNF1 as a potential RNA-binding E3 ligase which links RNA dependent processes with protein ubiquitination to regulate gene expression. Importance RBULs provide a link between RNA-mediated processes with the ubiquitin system. Only a few RBULs have been identified and none has been characterized in the malaria parasite P. falciparum . In this study, we unveiled the interactome of the putative P. falciparum E3 ligase Pf RNF1. We show that Pf RNF1 interacts with both proteins of the ubiquitin system as well as RNA-binding proteins therefore indicating that it is a putative RBUL which links RNA regulation with the ubiquitin system in P. falciparum .