Abstract Systemic pan-tumor analyses may reveal the significance of common features implicated in cancer immunogenicity and patient survival. Here, we provide a comprehensive multi-omics data set for 32 patients across 25 tumor types by combining proteogenomics with phenotypic and functional analyses. By using an optimized computational approach, we discovered a large number of novel tumor-specific and tumor-associated antigens including shared common target candidates. To create a pipeline for the identification of neoantigens in our cohort, we combined deep DNA and RNA sequencing with MS- based immunopeptidomics of tumor specimens, followed by the assessment of their immunogenicity. In fact, we could detect a broad variety of non-wild type HLA-binding peptides in the majority of patients and confirmed the immunogenicity of 24 neoantigens. Most interestingly, the majority of total and immunogenic neoantigens originated from variants identified in the RNA dataset, illustrating the importance of RNA as a still understudied source of cancer antigens. Moreover, the amount of these mainly RNA-based immunogenic neoantigens correlated positively with overall CD8 + tumor-infiltrating T cells. This study therefore underlines the importance of RNA-centered variant detection for the identification of shared biomarkers and potentially relevant neoantigen candidates. Statement of significance The significance of this study lies not only in the potential of our optimized proteogenomic workflow for the discovery of neoantigens (in particular RNA-derived neoantigens) for clinical application, but sheds light on the entity-agnostic prevalence of HLA class I peptide presentation of RNA processing events to be used for tumor targeting.

Abstract Neoantigens derived from somatic mutations have been demonstrated to correlate with therapeutic responses mediated by treatment with immune checkpoint inhibitors. Neoantigens are therefore highly attractive targets for the development of personalized medicine approaches although their quality and associated immune responses is not yet well understood. In a case study of metastatic malignant melanoma, we performed an in-depth characterization of neoantigens and respective T-cell responses in the context of immunotherapy with Ipilimumab. Three neoantigens identified either by immunopeptidomics or in silico prediction were investigated using binding affinity analyses and structural simulations. We isolated seven T-cell receptors (TCRs) from the patient immune repertoire recognizing these antigens. TCRs were compared in-vitro and in-vivo with multi-parametric analyses. Identified immunogenic peptides showed similar binding affinities to the human leukocyte antigen (HLA) complex and comparable differences to their wildtype counterparts in molecular dynamic simulations. Nevertheless, isolated TCRs differed substantially in functionality and frequency. In fact, TCRs with comparably lower functional avidity and higher potential for cross-reactivity provided at least equal anti-tumor immune responses in vivo. Of note, these TCRs showed a reduced activation pattern upon primary in vitro stimulation. Exploration of the TCR-β repertoire in blood and in different tumor-related tissues over three years, offered insights on the high frequency and particular long-term persistence of low-avidity TCRs. These data indicate that qualitative differences of neoantigen-specific TCRs and their impact on function and longevity need to be considered for neoantigen targeting by adoptive T-cell therapy using TCR-transgenic T cells. Statement of translational relevance Immunotherapy has demonstrated high efficacy in diverse malignancies. Neoantigens derived from mutations provide promising targets for safe and highly tumor-specific therapeutic approaches. Yet, single determinants of an effective and enduring T-cell mediated tumor rejection are still not well understood. We analyzed in detail seven neoantigen-specific T-cell receptors (TCRs) derived from a melanoma patient targeting three different altered peptide ligands identified by mass spectrometry and prediction analyses. Functional characterization of these TCRs revealed potent anti-tumor reactivity of all TCRs. Of special interest, TCRs with comparably lower affinity demonstrated effective in vivo activity as well as dominant spatial and temporal distribution in blood and tissue. Functional differences of TCR may require further T-cell and/or TCR engineering and should be considered for future clinical trial designs.

Although most hepatocellular carcinoma (HCC) cases are driven by hepatitis and cirrhosis, a subset of patients with chronic hepatitis B develop HCC in the absence of advanced liver disease, indicating the oncogenic potential of hepatitis B virus (HBV). We investigated the role of HBV transcripts and proteins on HCC development in the absence of inflammation in HBV-transgenic mice.

e13609 Background: Precision oncology revolutionized cancer treatment by identifying molecular biomarkers to guide personalized care. The ever-growing body of medical literature presents a challenge for oncologists researching targeted therapies. While recent studies investigated large language models (LLMs) to streamline this process, LLM reliance on general rather than medical knowledge limits clinical relevance and trustworthiness. To address these limitations, we developed a retrieval augmented generation (RAG) system that integrates PubMed clinical studies, trial databases and oncological guidelines with LLMs to support targeted treatment recommendations. The Molecular Tumor Board (MTB) at the Center of Personalized Medicine (ZPM TUM ) guided and evaluated treatment options proposed by the LLM to assess their applicability for clinical decision support. Methods: We used 10 publicly accessible fictional patient cases with 7 tumor types and 59 distinct molecular alterations. Our LLM system MEREDITH (Medical Evidence Retrieval and Data Integration for Tailored Healthcare) consists of Google's Gemini Pro, enhanced with RAG and Chain-of-Thought (CoT) prompting. To establish a benchmark, clinical experts at ZPM TUM manually annotated the cases. Informed by MTB expert feedback, we iteratively improved our LLM system from a draft system relying on PubMed-indexed data to an enhanced system, which replicated expert annotation processes by incorporating oncology guidelines, drug availability and trial databases (ClinicalTrials.gov, QuickQueck.de). ZPM TUM assessed credibility and clinical relevance of manually annotated and LLM-generated recommendations. Patient-level data on (likely) pathogenic molecular alterations and recommended treatment options were summarized using median and interquartile range (IQR). Semantic similarity between LLM and clinician responses was assessed using cosine similarity of text vector embeddings; paired t-test evaluated significance. Results: The median of (likely) pathogenic molecular alterations per patient was 2.5 (IQR: 2-3). ZPM TUM identified a median of 2 treatment options per patient (IQR: 1-3), while the enhanced LLM identified a median of 4 (IQR: 3-5). MEREDITH proposed multiple relevant treatment suggestions, including therapies based on preclinical studies, and molecular interactions, for further assessment by the MTB. ZPM TUM prioritized the most suitable clinical option. The mean semantic textual similarity of LLM responses increased significantly from 0.69 in the draft system to 0.76 in the enhanced system (p <0.001). Thus, feedback from ZPM TUM enhanced the model's ability to align its responses with clinician thought processes. Conclusions: Leveraging expert thought processes to instruct LLMs holds promise as a novel decision support tool for precision oncology.