SUMMARY This study develops a versatile cell multiplexing and data analysis platform to gain knowledge gain into mechanisms of cell differentiation. We engineer a cell barcoding system in human cells enabling multiplexed single-cell RNA sequencing for high throughput perturbation of customisable and diverse experimental conditions. This is coupled with a new computational analysis pipeline that overcomes the limitations of conventional algorithms by using an unsupervised, genome-wide, orthogonal biological reference point to reveal the cell diversity and regulatory networks in the input scRNA-seq data set. We implement this pipeline by engineering transcribed barcodes into induced pluripotent stem cells and multiplex 62 independent experimental conditions comprising eight differentiation time points and nine developmental signalling perturbations in duplicates. We identify and deconstruct the temporal, signalling, and gene regulatory imperatives of iPSC differentiation into cell types of ectoderm, mesoderm, and endoderm lineages. This study provides a cellular and computational pipeline to study cell differentiation applicable to studies in developmental biology, drug discovery, and disease modelling.

Abstract Methods for cell clustering and gene expression from single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) data are essential for biological interpretation of cell processes. Here we present TRIAGE-Cluster which uses genome-wide epigenetic data from diverse bio-samples to identify genes demarcating cell diversity in scRNA-seq data. TRIAGE-Cluster integrates patterns of repressive chromatin deposited across diverse cell types with weighted density estimation to determine cell type clusters in a 2D UMAP space. We then present TRIAGE-ParseR, a machine learning method that evaluates gene expression rank lists to define gene groups governing the identity and function of cell types. We demonstrate the utility of this two-step approach using atlases of in vivo and in vitro cell diversification and organogenesis. We also provide a web accessible dashboard for analysis and download of data and software. Collectively, genome-wide epigenetic repression provides a versatile strategy to define cell diversity and study gene regulation of scRNA-seq data.

Determining genes orchestrating cell identity and function in development and disease remains a fundamental goal of cell biology. This study establishes a genome-wide metric based on the gene-repressive tri-methylation of histone 3 lysine 27 as deposited in over 100 human cell states from representative tissues and cell lines. On its own, the tendency of broad H3K27me3 occupancy at promoters strongly enriches for genes that drive cell diversification and fates. We show that the discordance between this repressive tendency and the abundance of expressed transcripts of any somatic cell type prioritizes cell type-specific regulatory genes in health and disease. We implement this repression-based regulatory logic to identify genetic drivers of cell identity across millions of genome-wide single cell transcriptomes, diverse omics platforms, and eukaryotic cells and tissue types. Its potential for novel gene discovery is demonstrated by experimentally validated predictions of previously unknown drivers of organ differentiation in two eukaryotic species, humans and Ciona . This simple and quantifiable regulatory inference analysis provides a novel and scalable computational approach to determine drivers of cell diversification and fates of any cell type from gene output alone.

Protocols for culturing cardiac cells derived from human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are critical for studying mechanisms of development and disease. This study provides analysis of a community-oriented database to assess parameters used in published cardiac differentiation protocols, including a web-accessible portal for user-guided customisation of protocols. Validation studies support context-dependent roles for media composition in deriving functional maturation of hiPSC-derived cardiomyocytes.