ABSTRACT CLASPs regulate microtubules in many fundamental cellular processes. CLASPs stabilize dynamic microtubules by suppressing catastrophe and promoting rescue, the switch-like transitions between microtubule growth and shrinkage. However, the molecular mechanisms underlying CLASP’s activity are not understood. Here, we investigate the effects of CLASPs on distinct microtubule substrates in the absence of tubulin to gain insight into how CLASPs regulate microtubule dynamics. Surprisingly, we find that human CLASP1 depolymerizes stable microtubules in the presence of GTP, but not in the absence of nucleotide. Conversely, CLASP1 stabilizes dynamic microtubules upon tubulin dilution in the presence of GTP. Our results demonstrate that CLASP1 drives microtubule substrates with different inherent stabilities into the same slowly-depolymerizing state in the absence of tubulin in a nucleotide-dependent manner. We interpret this state as the pre-catastrophe intermediate state between microtubule growth and shrinkage. Thus, we conclude that CLASPs stabilize the intermediate state between microtubule growth and shrinkage to suppress microtubule catastrophe and promote rescue.

ABSTRACT The GTP-tubulin cap is widely accepted to protect microtubules against catastrophe. The GTP-cap size is thought to increase with the microtubule growth rate, presumably endowing fast-growing microtubules with enhanced stability. It is unknown what GTP-cap properties permit frequent microtubule catastrophe despite fast growth. Here, we investigate microtubules grown in vitro in the presence and absence of the microtubule polymerase XMAP215. Using EB1 as a GTP-cap marker, we find that GTP-cap size increases regardless of whether growth acceleration is achieved by increasing tubulin concentration or by XMAP215. In spite of the increased mean GTP-cap size, microtubules grown with XMAP215 display increased catastrophe frequency, in contrast to microtubules grown with more tubulin, for which catastrophe is abolished. However, microtubules polymerized with XMAP215 have large fluctuations in growth rate and EB1 intensity; display tapered and curled ends; and undergo catastrophe at faster growth rates and with higher EB1 end-localization. Our results underscore the role of growth irregularities in overall microtubule stability.

ABSTRACT Microtubules (MTs) are cytoskeletal fibers that undergo dynamic instability (DI), a remarkable process involving phases of growth and shortening separated by stochastic transitions called catastrophe and rescue. Dissecting dynamic instability mechanism(s) requires first characterizing and quantifying these dynamics, a subjective process that often ignores complexity in MT behavior. We present a S tatistical T ool for A utomated D ynamic I nstability A nalysis (STADIA), which identifies and quantifies not only growth and shortening, but also a category of intermediate behaviors that we term ‘stutters.’ During stutters, the rate of MT length change tends to be smaller in magnitude than during typical growth or shortening phases. Quantifying stutters and other behaviors with STADIA demonstrates that stutters precede most catastrophes in our dimer-scale MT simulations and in vitro experiments, suggesting that stutters are mechanistically involved in catastrophes. Related to this idea, we show that the anti-catastrophe factor CLASP2γ works by promoting the return of stuttering MTs to growth. STADIA enables more comprehensive and data-driven analysis of MT dynamics compared to previous methods. The treatment of stutters as distinct and quantifiable DI behaviors provides new opportunities for analyzing mechanisms of MT dynamics and their regulation by binding proteins.

ABSTRACT Microvilli are conserved actin-based surface protrusions that have been repurposed throughout evolution to fulfill diverse cell functions. In the case of transporting epithelia, microvilli are supported by a core of actin filaments bundled in parallel by villin, fimbrin, and espin. Remarkably, microvilli biogenesis persists in mice lacking all three of these factors, suggesting the existence of unknown bundlers. We identified Mitotic Spindle Positioning (MISP) as an actin binding factor that localizes specifically to the rootlet end of the microvillus. MISP promotes rootlet elongation in cells, and purified MISP exhibits potent filament bundling activity in vitro . MISP-bundled filaments also recruit fimbrin, which further elongates and stabilizes bundles. MISP confinement to the rootlet is enforced by ezrin, which prevents decoration of the membrane-wrapped distal end of the core bundle. These discoveries reveal how epithelial cells optimize apical membrane surface area and offer insight on the remarkable robustness of microvilli biogenesis.

Abstract Heterogeneity of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) in pancreatic islets is physiologically important but poorly understood. Here, we utilize whole mouse islets to determine how microtubules affect secretion toward the vascular extracellular matrix. Our data indicate that microtubule stability in the β-cell population is heterogenous, and that cells with more stable microtubules secrete less in response to a stimulus. Consistently, microtubule hyper-stabilization prevents, and microtubule depolymerization promotes β-cell activation. Analysis of spatiotemporal patterns of secretion events shows that microtubule depolymerization activates otherwise dormant β-cells via initiation of secretion clusters (hot spots). Microtubule depolymerization also enhances secretion from individual cells, introducing both additional clusters and scattered events. Interestingly, without microtubules, the timing of clustered secretion is dysregulated, extending the first phase of GSIS. Our findings uncover a novel microtubule function in tuning insulin secretion hot spots, which leads to accurately measured and timed response to glucose stimuli and promotes functional β-cell heterogeneity.

ABSTRACT Sjögren’s Syndrome Nuclear Autoantigen 1 (SSNA1/NA14) is a microtubule-associated protein with important functions in cilia, dividing cells and developing neurons. However, the direct effects of SSNA1 on microtubules are not known. We employed in vitro reconstitution with purified proteins and TIRF microscopy to investigate the activity of human SSNA1 on dynamic microtubule ends and lattices. We find that SSNA1 modulates all parameters of microtubule dynamic instability – slowing down the rates of growth, shrinkage and catastrophe, and promoting rescue. SSNA1 accumulation on dynamic microtubule ends correlates with the growth rate slow-down. Furthermore, SSNA1 prevents catastrophe when soluble tubulin is removed or sequestered by Op18/Stathmin. Finally, SSNA1 detects spastin-induced damage and inhibits spastin’s severing activity. Therefore, SSNA1 is both a potent microtubule stabilizing protein and a sensor of microtubule damage; activities that likely underlie SSNA1’s cellular functions.

ABSTRACT Coordination between the microtubule and actin networks is essential for cell motility, neuronal growth cone guidance, and wound healing. Members of the CLASP (Cytoplasmic Linker-Associated Protein) family of proteins have been implicated in the cytoskeletal crosstalk between microtubules and actin networks, however, the molecular mechanisms underlying CLASPs role in cytoskeletal coordination are unclear. Here, we investigate CLASP2α’s crosslinking function with microtubules and F-actin. Our results demonstrate that CLASP2α crosslinks F-actin to the microtubule lattice in vitro. We find that the crosslinking ability is retained by L-TOG2-S, a minimal construct containing the TOG2 domain and serine-arginine rich region of CLASP2α. Furthermore, CLASP2α promotes the accumulation of multiple actin filaments along the microtubule, supporting up to 11 F-actin landing events on a single microtubule lattice region. CLASP2α also facilitates dynamic organization of polymerizing actin filaments templated by the microtubule network, with F-actin forming bridges between individual microtubules. Finally, we find that depletion of CLASPs in vascular smooth muscle cells results in disorganized actin fibers and reduced co-alignment of actin fibers with microtubules, suggesting that CLASP and microtubules contribute to higher-order actin structures. Taken together, our results indicate that CLASP2α can directly crosslink F-actin to microtubules, and that this microtubule-CLASP-actin interaction may influence overall cytoskeletal organization in cells.

Higher-order structures of the microtubule (MT) cytoskeleton are comprised of two architectures: bundles and asters. Although both architectures are critical for cellular function, the molecular pathways that drive aster formation are poorly understood. Here, we study aster formation by human minus-end directed kinesin-14 (HSET/KIFC1). We show that HSET is incapable of forming asters from pre-formed, non-growing MTs, but rapidly forms MT asters in the presence of soluble tubulin. HSET binds soluble (non-polymer) tubulin via its N-terminal tail domain to form heterogeneous HSET-tubulin 'clusters' containing multiple motors. Cluster formation induces motor processivity and rescues the formation of asters from non-growing MTs. We then show that excess soluble tubulin stimulates aster formation in HeLa cells overexpressing HSET during mitosis. We propose a model where HSET can toggle between MT bundle and aster formation in a manner governed by the availability of soluble tubulin.

The microtubule binding protein EB1 specifically targets the growing ends of microtubules in cells, where EB1 facilitates the interactions of cellular proteins with microtubule plus-ends. Microtubule end targeting of EB1 has been attributed to high affinity binding of EB1 to GTP-tubulin that is present at growing microtubule ends. However, our 3D single-molecule diffusion simulations predicted a ~6000% increase in EB1 arrivals to open, tapered microtubule tip structures relative to closed lattice conformations. Using quantitative fluorescence, single-molecule, and electron microscopy experiments, we found that the binding of EB1 onto opened, structurally disrupted microtubules was dramatically increased relative to closed, intact microtubules, regardless of hydrolysis state. Correspondingly, in cells, the conversion of growing microtubule ends from a tapered into a blunt configuration resulted in reduced EB1 targeting. Together, our results suggest that microtubule structural recognition, based on a fundamental diffusion-limited binding model, facilitates the tip tracking of EB1 at growing microtubule ends.