Is the mechanical unraveling of protein domains by atomic force microscopy (AFM) just a technological feat or a true measurement of their unfolding? By engineering a protein made of tandem repeats of identical Ig modules, we were able to get explicit AFM data on the unfolding rate of a single protein domain that can be accurately extrapolated to zero force. We compare this with chemical unfolding rates for untethered modules extrapolated to 0 M denaturant. The unfolding rates obtained by the two methods are the same. Furthermore, the transition state for unfolding appears at the same position on the folding pathway when assessed by either method. These results indicate that mechanical unfolding of a single protein by AFM does indeed reflect the same event that is observed in traditional unfolding experiments. The way is now open for the extensive use of AFM to measure folding reactions at the single-molecule level. Single-molecule AFM recordings have the added advantage that they define the reaction coordinate and expose rare unfolding events that cannot be observed in the absence of chemical denaturants.

Abstract The BCL-2 family is a challenging set of proteins to target selectively due to sequence and structural homologies across the family. Selective ligands for the BCL-2 family regulators of apoptosis are desirable as probes to understand cell biology and apoptotic signalling pathways, and as starting points for inhibitor design. We have used phage display to isolate Affimer reagents (non-antibody binding proteins based on a conserved scaffold) to identify ligands for MCL-1, BCL-xL, BCL-2, BAK and BAX, then used multiple biophysical characterisation methods to probe the interactions. We established that purified Affimers elicit selective and potent recognition of their target BCL-2 protein. For anti-apoptotic targets, competitive inhibition of their canonical protein-protein interactions is demonstrated. Co-crystal structures reveal an unprecedented mode of molecular recognition; where a BH3 helix is normally bound, flexible loops from the Affimer dock into the BH3 binding cleft. Moreover, the Affimers induce a change in the target proteins towards a desirable drug bound like conformation. These results indicate Affimers can be used as alternative templates to inspire design of selective BCL-2 family modulators, and provide proof-of-concept for the elaboration of selective non-antibody binding reagents for use in cell-biology applications.

The health of a cell depends on accurate translation and proper protein folding; misfolding can lead to aggregation and disease. The first opportunity for a protein to fold occurs during translation, when the ribosome and surrounding environment can affect the energy landscape of the nascent chain. However, quantifying these environmental effects is challenging due to the ribosomal proteins and rRNA, which preclude most spectroscopic measurements of protein energetics. We have applied two gel-based approaches, pulse proteolysis and force-peptide arrest assays, to probe the folding and unfolding pathways of RNase H ribosome-stalled nascent chains. We find that ribosome-stalled RNase H has an increased unfolding rate compared to free RNase H, which completely accounts for observed changes in protein stability and indicates that the folding rate is unchanged. Using arrest peptide-based force-profile analysis, we assayed the force generated during the folding of RNase H on the ribosome. Surprisingly, we find that population of the RNase H folding intermediate is required to generate sufficient force to release the SecM stall and that readthrough of the stall sequence directly correlates with the stability of the folding intermediate. Together, these data imply that the folding pathway of RNase H is unchanged on the ribosome. Furthermore, our data indicate that the ribosome promotes unfolding while the nascent chain is proximal to the ribosome, which may limit the deleterious effects of misfolding and assist in folding fidelity.

BCL-2 proteins control the intrinsic pathway of programmed cell death. Composed of anti- and pro-apoptotic members, their network of interactions forms a molecular switch that controls mitochondrial outer-membrane permeability. Apoptotic stimulation leads to BAK/BAX oligomerization and pore formation, yet the molecular details of this pivotal step remain poorly understood, and controversy persists regarding the activation mechanism. Here we use native mass spectrometry and kinetics to show that the homooligomerization of BAK and BAX is spontaneous in hydrophobic environments. This process is abrogated by hetero-dimerization of both BAK and BAX with the antiapoptotic BCL-2 protein MCL-1. Pro-apoptotic BH3-only proteins disrupt these heterodimers by binding competitively to MCL-1, releasing BAK/BAX for homooligomerization. Thus, we infer that their oligomeric states are thermodynamically favored at the membrane. Our approach provides the framework for future quantitative biophysical characterizations of the BCL-2 network, and advances our molecular understanding of apoptosis.

Recent experimental and computational studies have shown the influence of internal friction in protein folding dynamics. However, uncertainty remains over its molecular origin. α-spectrin experimental results indicate that R15 domain folds three orders of magnitude faster than its homologous R16 and R17. Such anomalous observations are usually attributed to the influence of internal friction on protein folding rates. To study this phenomenon, we carried out molecular dynamics simulations with structure-based Cα models, in which the folding process of α-spectrin domains was investigated by adding non-native interactions. The simulations take into account the hydrophobic and the electrostatic contributions separately. The folding time results have shown a qualitative agreement with experimental data. We have also investigated mutations in R16 and R17, and the simulation folding time results correlate with the observed experimental ones. We suggest that the origin of the internal friction emerges from a cooperativity effect of these non-native interactions.

The BCL-2 family is a challenging set of proteins to target selectively due to sequence and structural homologies across the family. Selective ligands for the BCL-2 family regulators of apoptosis are desirable as probes to understand cell biology and apoptotic signalling pathways, and as starting points for inhibitor design. We have used phage display to isolate Affimer reagents (non-antibody binding proteins based on a conserved scaffold) to identify ligands for MCL-1, BCL-xL, BCL-2, BAK and BAX, then used multiple biophysical characterisation methods to probe the interactions. We established that purified Affimers elicit selective and potent recognition of their target BCL-2 protein. For anti-apoptotic targets, competitive inhibition of their canonical protein-protein interactions is demonstrated. Co-crystal structures reveal an unprecedented mode of molecular recognition; where a BH3 helix is normally bound, flexible loops from the Affimer dock into the BH3 binding cleft. Moreover, the Affimers induce a change in the target proteins towards a desirable drug bound like conformation. These results indicate Affimers can be used as alternative templates to inspire design of selective BCL-2 family modulators, and provide proof-of- concept for the elaboration of selective non-antibody binding reagents for use in cell-biology applications.

Proteins that fold cotranslationally may do so in a restricted configurational space, due to the volume occupied by the ribosome. How does this environment, coupled with the close proximity of the ribosome, affect the folding pathway of a protein? Previous studies have shown that the cotranslational folding process for many proteins, including small, single domains, is directly affected by the ribosome. Here, we investigate the cotranslational folding of an all-β immunoglobulin domain, titin I27. Using an arrest peptide-based assay and structural studies by cryo-EM, we show that I27 folds in the mouth of the ribosome exit tunnel. Simulations that use a kinetic model for the force-dependence of escape from arrest, accurately predict the fraction of folded protein as a function of length. We used these simulations to probe the folding pathway on and off the ribosome. Our simulations - which also reproduce experiments on mutant forms of I27 - show that I27 folds, while still sequestered in the mouth of the ribosome exit tunnel, by essentially the same pathway as free I27, with only subtle shifts of critical contacts from the C to the N terminus.

The evolution of antifreeze glycoproteins has enabled notothenioid fish to flourish in the freezing waters of the Southern Ocean. Whilst successful at the biodiversity level to life in the cold, paradoxically at the cellular level these stenothermal animals have problems producing, folding and degrading proteins at their ambient temperatures of down to -1.86 degrees Celsius. In this first multi-species transcriptome comparison of the amino acid composition of notothenioid proteins with temperate teleost proteins, we show that, unlike psychrophilic bacteria, Antarctic fish provide little evidence for the mass alteration of protein amino acid composition to enhance protein folding and reduce protein denaturation in the cold. The exception was the significant over-representation of positions where leucine in temperate fish proteins was replaced by methionine in the notothenioid orthologues. Although methionine may increase stability in critical proteins, we hypothesise that a more likely explanation for the extra methionines is that they have been preferentially assimilated into the genome because they act as redox sensors. This redox hypothesis is supported by the enrichment of duplicated genes within the notothenioid transcriptomes which centre around Mapk signalling, a major pathway in the cellular cascades associated with responses to environmental stress. Whilst notothenioid fish show cold-associated problems with protein homeostasis, they may have modified only a selected number of biochemical pathways to work efficiently below 0 degrees Celsius. Even a slight warming of the Southern Ocean might disrupt the critical functions of this handful of key pathways with considerable impacts for the functioning of this ecosystem in the future.