Plasmids harbor transferable genes that contribute to the functional repertoire of microbial communities, yet their contributions to metagenomes are often overlooked. Environmental plasmids have the potential to spread antibiotic resistance to clinical microbial strains. In soils, high microbiome diversity and high variability in plasmid characteristics present a challenge for studying plasmids. To improve understanding of soil plasmids, we present RefSoil+, a database containing plasmid sequences from 922 soil microorganisms. Soil plasmids were relatively larger than other described plasmids, which is a trait associated with plasmid mobility. There was no relationship between chromosome size and plasmid size or number, suggesting that these genomic traits are independent in soil. Soil-associated plasmids, but not chromosomes, had fewer antibiotic resistance genes than other microorganisms. These data suggest that soils may offer limited opportunity for plasmid-mediated transfer of described antibiotic resistance genes. RefSoil+ can serve as a baseline for the diversity, composition, and host-associations of plasmid-borne functional genes in soil, a utility that will be enhanced as the database expands. Our study improves understanding of soil plasmids and provides a resource for assessing the dynamics of the genes that they carry, especially genes conferring antibiotic resistances.

Here, we report our educational approach and learner evaluations of the first five years of the Explorations in Data Analysis for Metagenomic Advances in Microbial Ecology (EDAMAME) workshop, held annually at Michigan State University's Kellogg Biological Station from 2014-2018. We hope this information will be useful for others who want to organize computing-intensive workshops and encourage quantitative skill development among microbiologists.

A database of curated genomes is needed to better assess soil microbial communities and their processes associated with differing land management and environmental impacts. Interpreting soil metagenomic datasets with existing sequence databases is challenging because these datasets are biased towards medical and biotechnology research and can result in misleading annotations. We have curated a database of 922 genomes of soil-associated organisms (888 bacteria and 34 archaea). Using this database, we evaluated phyla and functions that are enriched in soils as well as those that may be underrepresented in RefSoil. Our comparison of RefSoil to soil amplicon datasets allowed us to identify targets that if cultured or sequenced would significantly increase the biodiversity represented within RefSoil. To demonstrate the opportunities to access these underrepresented targets, we employed single cell genomics in a pilot experiment to sequence 14 genomes. This effort demonstrates the value of RefSoil in the guidance of future research efforts and the capability of single cell genomics as a practical means to fill the existing genomic data gaps.

ABSTRACT High throughput primer design is needed to simultaneously design primers for multiple genes of interest, such as a group of functional genes. We have developed MetaFunPrimer, a bioinformatic pipeline to design primer targets for genes of interests, with a prioritization based on ranking the presence of gene targets in references, such as metagenomes. MetaFunPrimer takes inputs of protein and nucleotide sequences for gene targets of interest accompanied by a set of reference metagenomes or genomes for determining genes of interest. Its output is a set of primers that may be used to amplify genes of interest. To demonstrate the usage and benefits of MetaFunPrimer, a total of 78 HT-qPCR primer pairs were designed to target observed ammonia monooxygenase subunit A ( amo A) genes of ammonia-oxidizing bacteria (AOB) in 1,550 soil metagenomes. We demonstrate that these primers can significantly improve targeting of amo A-AOB genes in soil metagenomes compared to previously published primers. IMPORTANCE Amplification-based gene characterization allows for sensitive and specific quantification of functional genes. Often, there is a large diversity of genes represented for a function of interest, and multiple primers may be necessary to target associated genes. Current primer design tools are limited to designing primers for only a few genes of interest. MetaFunPrimer allows for high throughput primer design for functional genes of interest and also allows for ranking gene targets by their presence and abundance in environmental datasets. This tool enables high throughput qPCR approaches for characterizing functional genes.

ABSTRACT Effective monitoring of antibiotic resistance genes and their dissemination in environmental ecosystems has been hindered by the cost and efficiency of methods available for the task. We developed a method entitled the Diversity of Antibiotic Resistance genes and Transfer Elements-Quantitative Monitoring (DARTE-QM), a system implementing high-throughput sequencing to simultaneously sequence thousands of antibiotic resistant genes representing a full-spectrum of antibiotic resistance classes commonly seen in environmental systems. In this study, we demonstrated DARTE-QM by screening 662 antibiotic resistance genes within environmental samples originated from manure, soil, and animal feces, in addition to a mock-community used as a control to test performance. DARTE-QM offers a new approach to studying antibiotic resistance in environmental microbiomes, showing advantages in efficiency and the ability to scale for many samples. This method provides a means of data acquisition that will alleviate the obstacles that many researchers in this area currently face.

Abstract Miscanthus x giganteus is a promising high-yielding perennial plant to meet growing bioenergy demands but the degree to which the soil microbiome affects its nitrogen cycling and subsequently, biomass yield remains unclear. In this study, we hypothesize that contributions of metabolically active soil microbial membership may be underestimated with DNA-based approaches. We assessed the response of the soil microbiome to nitrogen availability in terms of both DNA and RNA soil microbial communities from the Long-term Assessment of Miscanthus Productivity and Sustainability (LAMPS) field trial. DNA and RNA were extracted from 271 samples, and 16S SSU rRNA amplicon sequencing was performed to characterize microbial community structure. Significant differences were observed in the resulting soil microbiomes and were best explained by the sequencing library of origin, either DNA and RNA. Similar numbers of taxa were detected in DNA and RNA microbial communities, with more than 90% of taxa shared. However, the profile of dominant taxa within DNA and RNA differed, with varying proportions of Actinobacteria and Proteobacteria and Firmicutes and Proteobacteria . Only RNA microbial communities showed seasonal responses to nitrogen fertilization, and these differences were associated with nitrogen-cycling bacteria. The relative abundance of bacteria associated with nitrogen cycling was 7-folds higher in RNA than in DNA, and genes associated with denitrifying bacteria were significantly enriched in RNA, suggesting that these bacteria may be underestimated with DNA-only approaches. Our findings indicate that RNA-based SSU characterization can be a significant and complementing resource for understanding the role of soil microbiomes in bioenergy crop production. Importance Miscanthus x giganteus is becoming a cornerstone of bioeconomy cropping systems, but it remains unclear how the soil microbiome supplies nitrogen to this low-input crop. DNA-based techniques are used to provide community characterization but may miss important metabolically active taxa. By analyzing both DNA- and actively transcribed RNA-based microbial communities, we found that nitrogen cycling taxa in the soil microbiome may be underestimated using only DNA-based approaches. Accurately understanding the role of microbes and how they cycle nutrients is important for the development of sustainable bioenergy crops, and RNA-based approaches are recommended as a complement to DNA approaches to better understand the microbial, plant, and management interactions.