The μ-opioid receptor (μOR) is a G-protein-coupled receptor (GPCR) and the target of most clinically and recreationally used opioids. The induced positive effects of analgesia and euphoria are mediated by μOR signalling through the adenylyl cyclase-inhibiting heterotrimeric G protein Gi. Here we present the 3.5 Å resolution cryo-electron microscopy structure of the μOR bound to the agonist peptide DAMGO and nucleotide-free Gi. DAMGO occupies the morphinan ligand pocket, with its N terminus interacting with conserved receptor residues and its C terminus engaging regions important for opioid-ligand selectivity. Comparison of the μOR–Gi complex to previously determined structures of other GPCRs bound to the stimulatory G protein Gs reveals differences in the position of transmembrane receptor helix 6 and in the interactions between the G protein α-subunit and the receptor core. Together, these results shed light on the structural features that contribute to the Gi protein-coupling specificity of the µOR. A cryo-electron structure of the µ-opioid receptor in complex with the peptide agonist DAMGO and the inhibitory G protein Gi reveals structural determinants of its G protein-binding specificity.

Staphylococcus aureus Sav1866 is a bacterial homolog of the human ABC transporter Mdr1 that causes multidrug resistance in cancer cells. We report the crystal structure of Sav1866 in complex with adenosine‐5′‐(β,γ‐imido)triphosphate (AMP‐PNP) at 3.4 Å resolution and compare it with the previously determined structure of Sav1866 with bound ADP. Besides differences in the ATP‐binding sites, no significant conformational changes were observed. The results confirm that the ATP‐bound state of multidrug ABC transporters is coupled to an outward‐facing conformation of the transmembrane domains.

Abstract The human glycine transporter 1 (GlyT1) regulates glycine mediated neuronal excitation and inhibition through sodium- and chloride-dependent reuptake of the neurotransmitter 1-3 . Inhibition of glycine reuptake via GlyT1 prolongs neurotransmitter signaling and has long served as a key therapeutic development strategy for treatment of a broad range of central nervous system disorders including schizophrenia and cognitive impairments 4 . Using an inhibition state-selective sybody and serial synchrotron crystallography, we determined the structure of GlyT1 in complex with a benzoylpiperazine chemotype inhibitor at 3.4 Å resolution. The inhibitor locks GlyT1 in an inward-open conformation and binds at the intracellular gate of the release pathway, overlapping with the glycine release site. The inhibitor likely reaches GlyT1 from the cytoplasmic leaflet of the plasma membrane. The study defines the mechanism of non-competitive inhibition and enables the rational design of new, clinically efficacious GlyT1 inhibitors.

Single domain antibodies called nanobodies are excellent affinity reagents for membrane proteins. However, their generation relies on immunizations, which is only amenable to robust proteins and impedes selections in the presence of non-covalent or toxic ligands. To overcome these key limitations, we developed a novel in vitro selection platform, which builds on synthetic nanobodies called sybodies. Inspired by the shape diversity of natural nanobodies, three sybody libraries exhibiting different randomized surface shapes were engineered for high thermal stability. Using ribosome display, exceptionally large libraries were pre-enriched against membrane protein targets and subsequently funneled into a robust phage display process, thereby reducing selection bias. We successfully generated conformation-selective, high affinity sybodies against the human glycine transporter GlyT1, the human equilibrative nucleotide transporter ENT1 and a bacterial ABC transporter. Our platform builds exclusively on commercially available reagents and enables non-specialized labs to generate conformation-specific binders against previously intractable protein targets.

Abstract G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest class of integral membrane proteins and represent key targets for pharmacological research. GPCRs modulate cell physiology by engaging and activating a diversity of intracellular transducers, prominently heterotrimeric G proteins, but also G protein-receptor kinases (GRKs) and arrestins. The recent surge in the number of structures of GPCR-G protein complexes has expanded our understanding of G protein recognition and GPCR-mediated signal transduction. However, many aspects of these mechanisms, including the existence of transient interactions with transducers, have remained elusive. Here, we present the cryo-EM structure of the light-sensitive GPCR rhodopsin in complex with heterotrimeric Gi. In contrast to all reported structures, our density map reveals the receptor C-terminal tail bound to the Gβ subunit of the G protein heterotrimer. This observation provides a structural foundation for the role of the C-terminal tail in GPCR signaling, and of Gβ as scaffold for recruiting Gα subunits and GRKs. By comparing all available complex structures, we found a small set of common anchoring points that are G protein-subtype specific. Taken together, our structure and analysis provide new structural basis for the molecular events of the GPCR signaling pathway.