ABSTRACT Isolation and characterization of antibodies in COVID-19 patients has largely focused on memory B cells, however it is the antibody-secreting plasma cells that are directly responsible for the production of serum antibodies, which play a critical role in controlling and resolving SARS-CoV-2 infection. To date there is little known about the specificity of plasma cells in COVID-19 patients. This is largely because plasma cells lack surface antibody expression, which complicates their screening. Here, we describe a technology pipeline that integrates single-cell antibody repertoire sequencing and high-throughput mammalian display screening to interrogate the specificity of plasma cells from 16 convalescent COVID-19 patients. Single-cell sequencing allows us to profile antibody repertoire features in these patients and identify highly expanded clonal lineages. Mammalian display screening is employed to reveal that 37 antibodies (out of 132 candidates) derived from expanded plasma cell clonal lineages are specific for SARS-CoV-2 antigens, including antibodies that target the receptor binding domain (RBD) with high affinity and exhibit potent neutralization of SARS-CoV-2. One Sentence Summary Single-cell antibody repertoire sequencing and high-throughput screening identifies highly expanded plasma cells from convalescent COVID-19 patients that produce SARS-CoV-2-specific antibodies capable of potent neutralization.

ABSTRACT T cell receptor (TCR) gene therapy is a promising cell therapy approach for the treatment of cancer. However, most naturally occurring TCRs display low affinities to their peptide-MHC targets, and engineering of TCRs for enhanced affinity is complicated by the risk of introducing cross-reactivity and the poor correlation between affinity and function. Here we report the establishment of the TCR-accepting T cell (TnT) platform through five sequential CRISPR-Cas9 genome editing steps of a human T cell line, and demonstrate its application for functional engineering of TCRs and prediction of cross-reactivity. Using the TnT platform, we profile the mutational landscapes of tumor-specific TCRs at high-throughput to reveal a substantial discordance between antigen binding and antigen-induced signaling. Furthermore, we combine CRISPR-targeting, functional selection and deep sequencing to screen TCR mutagenesis libraries and identify variants with enhanced recognition of the cancer-testis antigen MAGE-A3. Finally, functional cross-reactivity profiling using TnT cells was able to accurately predict off-targets and identify engineered TCRs with exquisite specificity to MAGE-A3. Thus, the TnT platform represents a valuable technology for the engineering of TCRs with enhanced functional and safety profiles.

Abstract COVID-19 disease outcome is highly dependent on adaptive immunity from T and B lymphocytes, which play a critical role in the control, clearance and long-term protection against SARS-CoV-2. To date, there is limited knowledge on the composition of the T and B cell immune receptor repertoires [T cell receptors (TCRs) and B cell receptors (BCRs)] and transcriptomes in convalescent COVID-19 patients of different age groups. Here, we utilize single-cell sequencing (scSeq) of lymphocyte immune repertoires and transcriptomes to quantitatively profile the adaptive immune response in COVID-19 patients of varying age. We discovered highly expanded T and B cells in multiple patients, with the most expanded clonotypes coming from the effector CD8 + T cell population. Highly expanded CD8 + and CD4 + T cell clones show elevated markers of cytotoxicity (CD8: PRF1, GZMH, GNLY; CD4: GZMA), whereas clonally expanded B cells show markers of transition into the plasma cell state and activation across patients. By comparing young and old convalescent COVID-19 patients (mean ages = 31 and 66.8 years, respectively), we found that clonally expanded B cells in young patients were predominantly of the IgA isotype and their BCRs had incurred higher levels of somatic hypermutation than elderly patients. In conclusion, our scSeq analysis defines the adaptive immune repertoire and transcriptome in convalescent COVID-19 patients and shows important age-related differences implicated in immunity against SARS-CoV-2.

Summary Existing approaches for the integration and expression of genes of interest in a desired human cellular context are marred by the safety concerns related to either the random nature of viral-mediated integration or unpredictable pattern of gene expression in currently employed targeted genomic integration sites. Disadvantages of these methods lead to their limited use in clinical practice, thus encouraging future research in identifying novel human genomic sites that allow for predictable and safe expression of genes of interest. We conducted a bioinformatic search followed by experimental validation of novel genomic sites and identified two that demonstrated stable expression of integrated reporter and therapeutic genes without detrimental changes to cellular transcriptome. The cell-type agnostic criteria used in our bioinformatic search suggest wide-scale applicability of our sites for engineering of a diverse range of tissues for therapeutic as well as enhancement purposes, including modified T-cells for cancer therapy and engineered skin to ameliorate inherited diseases and aging. Additionally, the stable and robust levels of gene expression from identified sites allow for their use in industry-scale biomanufacturing of desired proteins in human cells.

Chimeric antigen receptors (CARs) consist of an extracellular antigen-binding region fused to intracellular signaling domains, thus enabling customized T cell responses against target cells. Due to the low-throughput process of systematically designing and functionally testing CARs, only a small set of immune signaling domains have been thoroughly explored, despite their major role in T cell activation, effector function and persistence. Here, we present speedingCARs, an integrated method for engineering CAR T cells by signaling domain shuffling and functional screening by single-cell sequencing. Leveraging the inherent modularity of natural signaling domains, we generated a diverse library of 180 unique CAR variants, which were genomically integrated into primary human T cells by CRISPR-Cas9. Functional and pooled screening of the CAR T cell library was performed by co-culture with tumor cells, followed by single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) and single-cell CAR sequencing (scCAR-seq), thus enabling high-throughput profiling of multi-dimensional cellular responses. This led to the discovery of several CAR variants that retained the ability to kill tumor cells, while also displaying diverse transcriptional signatures and T cell phenotypes. In summary, speedingCARs substantially expands and characterizes the signaling domain combinations suited for CAR design and supports the engineering of next-generation T cell therapies.