Abstract Protein nanomaterial design is an emerging discipline with applications in medicine and beyond. A longstanding design approach uses genetic fusion to join protein homo-oligomer subunits via α-helical linkers to form more complex symmetric assemblies, but this method is hampered by linker flexibility and a dearth of geometric solutions. Here, we describe a general computational method that performs rigid three-body fusion of homo-oligomer and spacer building blocks to generate user-defined architectures, while at the same time significantly increasing the number of geometric solutions over typical symmetric fusion. The fusion junctions are then optimized using Rosetta to minimize flexibility. We apply this method to design and test 92 dihedral symmetric protein assemblies from a set of designed homo-dimers and repeat protein building blocks. Experimental validation by native mass spectrometry, small angle X-ray scattering, and negative-stain single-particle electron microscopy confirms the assembly states for 11 designs. Most of these assemblies are constructed from DARPins (designed ankyrin repeat proteins), anchored on one end by α-helical fusion and on the other by a designed homo-dimer interface, and we explored their use for cryo-EM structure determination by incorporating DARPin variants selected to bind targets of interest. Although the target resolution was limited by preferred orientation effects, small scaffold size, and the low-order symmetry of these dihedral scaffolds, we found that the dual anchoring strategy reduced the flexibility of the target-DARPIN complex with respect to the overall assembly, suggesting that multipoint anchoring of binding domains could contribute to cryo-EM structure determination of small proteins.

The exon junction complex (EJC) deposited upstream of mRNA exon junctions shapes structure, composition and fate of spliced mRNA ribonucleoprotein particles (mRNPs). To achieve this, the EJC core nucleates assembly of a dynamic shell of peripheral proteins that function in diverse post-transcriptional processes. To illuminate consequences of EJC composition change, we purified EJCs from human cells via peripheral proteins RNPS1 and CASC3. We show that EJC originates as an SR-rich mega-dalton sized RNP that contains RNPS1 but lacks CASC3. After mRNP export to the cytoplasm and before translation, the EJC undergoes a remarkable compositional and structural remodeling into an SR-devoid monomeric complex that contains CASC3. Surprisingly, RNPS1 is important for nonsense-mediated mRNA decay (NMD) in general whereas CASC3 is needed for NMD of only select mRNAs. The promotion of switch to CASC3-EJC slows down NMD. Overall, the EJC compositional switch dramatically alters mRNP structure and specifies two distinct phases of EJC-dependent NMD.

Plants boost the expression of pseudo-enzyme PDX1.2 under heat stress and during embryonic development. PDX1.2 positively regulates vitamin B6 production by hetero-association with its active catalytic homologs such as PDX1.1 and PDX1.3. These heterologous interactions were found challenging to understand. For instance, the crystals of PDX1.2-PDX1.3 heterocomplexes were found to be statistically disordered and individual proteins could not be assigned. Using a combination of biochemical and structural tools, we find that the key to this phenomenon is the nature of PDX1.2 hetero-assembly with its catalytic counterparts. Using a cell-free protein synthesis approach, we were able to set up a precise control of co-expression where we systematically varied the ratios of co-produced proteins by tuning the ratios of input DNA. These were further analyzed by Native Mass Spectrometry, which elucidated that 6-8 hetero-complex species of dodecamers of variable stoichiometry are produced for each co-expression condition tested. This is in contrast to previous hypothesis of stacked inter-hexamer assembly mechanism. As proposed previously, our high-resolution Cryo-EM structure of pseudo-enzyme PDX1.2 closely mimics the fold of PDX1.3 and maintains all necessary protein-protein interactions between subunits. In PDX1.2, the altered catalytic site P1 appears perturbed in concordance with its lack of activity, while the P2 site appears largely unchanged. The most surprising finding is that we observe a complete switch in the surface electrostatics for PDX1.2. Based on the activity assays and its structure, we hypothesize that the change in electrostatic would have a significant impact on the neighboring P2 site of the PDX1.3 and influence the turnover efficiency at that site. These data suggest that pseudo-enzyme PDX1.2 rather acts as an electrostatic tuning module, that, in combination with its hetero-assembly mechanism based on random incorporation, imposes a perfect regulatory control of such important process.

Abstract The ability of naturally occurring transmembrane β-barrel proteins (TMBs) to spontaneously insert into lipid bilayers and form stable transmembrane pores is a remarkable feat of protein evolution and has been exploited in biotechnology for applications ranging from single molecule DNA and protein sequencing to biomimetic filtration membranes. Because it has not been possible to design TMBs from first principles, these efforts have relied on re-engineering of naturally occurring TMBs that generally have a biological function very different from that desired. Here we leverage the power of de novo computational design coupled with a “hypothesis, design and test” approach to determine principles underlying TMB structure and folding, and find that, unlike almost all other classes of protein, locally destabilizing sequences in both the β-turns and β-strands facilitate TMB expression and global folding by modulating the kinetics of folding and the competition between soluble misfolding and proper folding into the lipid bilayer. We use these principles to design new eight stranded TMBs with sequences unrelated to any known TMB and show that they insert and fold into detergent micelles and synthetic lipid membranes. The designed proteins fold more rapidly and reversibly in lipid membranes than the TMB domain of the model native protein OmpA, and high resolution NMR and X-ray crystal structures of one of the designs are very close to the computational model. The ability to design TMBs from first principles opens the door to custom design of TMBs for biotechnology and demonstrates the value of de novo design to investigate basic protein folding problems that are otherwise hidden by evolutionary history. One sentence summary Success in de novo design of transmembrane β-barrels reveals geometric and sequence constraints on the fold and paves the way to design of custom pores for sequencing and other single-molecule analytical applications.