ABSTRACT Paediatric high grade glioma and diffuse midline glioma (including DIPG) are comprised of multiple biological and clinical subgroups, the majority of which urgently require novel therapies. Patient-derived in vitro primary cell cultures represent potentially useful tools for mechanistic and preclinical investigation based upon their retention of key features of tumour subgroups under experimental conditions amenable to high-throughput approaches. We present 17 novel primary cultures derived from patients in London, Dublin and Belfast, and together with cultures established or shared from Barcelona, Brisbane, Rome and Stanford, assembled a panel of 52 models under 2D (laminin matrix) and/or 3D (neurospheres) conditions, fully credentialed by phenotypic and molecular comparison to the original tumour sample (methylation BeadArray, panel/exome sequencing, RNAseq). In screening a subset of these against a panel of ~400 approved chemotherapeutics and small molecules, we identified specific dependencies associated with tumour subgroups and/or specific molecular markers. These included MYCN -amplified cells and ATM/DNA-PK inhibitors, and DIPGs with PPM1D activating truncating mutations and inhibitors of MDM2 or PARP1. Specific mutations in PDGFRA were found to confer sensitivity to a range of RTK inhibitors, though not all such mutations conferred sensitivity to targeted agents. Notably, dual PDGFRA/FGFR and downstream pathway MEK inhibitors showed profound effects against both PDGFRA-sensitising mutant and FGFR1-dependent non-brainstem pHGG and DIPG. In total, 85% cells were found to have at least one drug screening hit in short term assays linked to the underlying biology of the patient’s tumour, providing a rational approach for individualised clinical translation.

Summary Medulloblastoma is currently sub-classified into distinct DNA methylation subgroups/subtypes with particular clinico-molecular features. Using RNA-seq in large well annotated cohorts of medulloblastoma we show that transcriptionally Group3 and Group4 medulloblastomas exist not as discrete types but as intermediates on a bipolar continuum between archetypal Group3 and Group4 entities. Continuum position is prognostic, reflects propensity for specific DNA copy-number changes, key switches in isoform/enhancer usage and RNA-editing. Examining scRNA-seq profiles we show intra-tumoral transcriptional heterogeneity along the continuum is limited in a subtype-dependent manner. By integrating with a human scRNA-seq reference atlas we show this continuum is mirrored by an equivalent continuum of transcriptional cell types in early fetal cerebellar development. We identify unique developmental niches for all four major subgroups and link each to a common developmental antecedent. Our findings show a transcriptional continuum arising from oncogenic disruption of highly specific fetal cerebellar cell types, linked to almost every aspect of Group3/Group4 molecular biology and clinico-pathology.

Abstract BACKGROUND Histone mutations (H3 K27M, H3 G34R/V) define subtypes of paediatric-type diffuse high-grade gliomas (HGG) (diffuse midline glioma (DMG), H3 K27-altered, diffuse hemispheric glioma (DHG), H3 G34-mutant). The WHO classification recognises exceptional cases where these mutations co-occur. We report one such case of a 2-year-old female presenting with neurological symptoms and lethargy. METHODS MRI imaging identified a brainstem lesion; a stereotactic needle biopsy was undertaken, followed by standard diagnostic neuropathology workflows including histology review, panel immunohistochemistry, DNA methylation profiling (Illumina EPIC BeadArrays, brain tumour classifier (MNP v12.5 R package)) and WES/WGS. Patient-derived in vitro cell cultures were established allowing further characterisation using RNAseq and chromatin immunoprecipitation assays with sequencing (ChIP-seq). RESULTS Histology showed diffusely infiltrating pleomorphic astrocytes, multinucleated cells, and conspicuous mitotic activity; the diagnosis was DMG, H3 K27-altered (immunohistochemistry: H3K27me3 loss, H3K27M positivity). DNA methylation profiling classified the tumour as ‘DMG, H3 K27-altered’ (calibrated score=0.99). WES/WGS revealed concurrent H3.1 K27M and G34R mutations (clonal, in the same reads) of HIST1H3C (H3C3), somatic variants in FGF11 and PIK3CA, and a pathogenic germline NBN variant. The RNAseq profile of the primary tumour and cell cultures clustered with H3 K27M-mutant tumours. Unbiased in vitro drug screening showed no selective sensitivities. ChIP-seq (H3K27ac, H3K27me3, H3K36me3, RNApol2 marks) showed features in keeping with DMG H3 K27M-mutant tumours (H3K27ac loci including OLIG2, IRX1/2, PKDCC). The patient was treated with adjuvant radiotherapy and everolimus, but progressed and passed away 13 months post-diagnosis. CONCLUSION This case is an exceptionally rare, complex variant of histone-mutant paediatric HGG, and the first reported occurrence in HIST1H3C (H3C3). It illustrates that in cis, the H3.1 K27M mutation demonstrates a dominance over molecular and clinical profiles compared to G34R, and highlights the importance of broad molecular profiling to identify such examples for further study.

Abstract BACKGROUND Paediatric-type diffuse high-grade glioma (PDHGG) are brain tumours occurring largely in children, classified into distinct subgroups based upon their location and defining molecular alterations, with very poor clinical outcomes. The presence of a wide diversity of genotypically- and phenotypically-distinct subclones within individual tumours provides a substantial barrier to developing effective treatments. METHODS To understand their role, and how this may be exploited therapeutically, we established 218 subclones in vitro from 8 patient-derived PDHGG different cell lines, and characterised them using single-cell and bulk multi-omic approaches linked to high-content phenotypic screening. RESULTS Highly migratory subpopulations of diffuse midline glioma (DMG) cells were isolated, whereby RNAseq and proteomics identified a specific metaprogram associated with migration, enriched in AP-1 target genes, and common across a series of DMG patient-derived cells. Data integration of scRNAseq/scATACseq showed an opening of the chromatin at loci such as the early development transcription factors FOS and JUN (AP-1 targets) associated with their overexpression in highly migratory cells. Co-culturing these subclones with less motile patient-matched counterparts conferred an enhanced migratory capacity in these cells, so we sought to abrogate this via high-throughput screening of over 900 compounds aimed at selectively targeting DMG subclones grown in co-culture. Inter-clonal interactions were disrupted by a diverse set of compound classes including previously identified secreted protein inhibitors (MMP2/9i). Moreover, hits were seen with numerous neuroactive drugs inhibiting a series of neural receptors, ion channels, and transporters shown to be highly expressed in subpopulations of DMG cells, and linked to a common mechanism of action via AP-1. CONCLUSIONS Clinically available neuroactive drugs may therefore represent a novel therapeutic approach in targeting highly migratory cells within DMG, which undergo chromatin remodelling to confer a pro-tumorigenic programme via upregulation of AP-1 targets.

Diffuse hemispheric gliomas, H3G34R/V-mutant (DHG-H3G34), are lethal brain tumors lacking targeted therapies. They originate from interneuronal precursors; however, leveraging this origin for therapeutic insights remains unexplored. Here, we delineate a cellular hierarchy along the interneuron lineage development continuum, revealing that DHG-H3G34 mirror spatial patterns of progenitor streams surrounding interneuron nests, as seen during human brain development. Integrating these findings with genome-wide CRISPR-Cas9 screens identifies genes upregulated in interneuron lineage progenitors as major dependencies. Among these, CDK6 emerges as a targetable vulnerability: DHG-H3G34 tumor cells show enhanced sensitivity to CDK4/6 inhibitors and a CDK6-specific degrader, promoting a shift toward more mature interneuron-like states, reducing tumor growth, and prolonging xenograft survival. Notably, a patient with progressive DHG-H3G34 treated with a CDK4/6 inhibitor achieved 17 months of stable disease. This study underscores interneuronal progenitor-like states, organized in characteristic niches, as a distinct vulnerability in DHG-H3G34, highlighting CDK6 as a promising clinically actionable target.

SUMMARY DIPG are characterised by histone H3K27M mutations, resulting in global loss of the repressive mark H3K27me3, although certain key loci are retained. We recently identified subclonal loss-of-function mutations in the H4 lysine methyltransferase KMT5B to be associated with enhanced invasion/migration, but the mechanism by which this occurred was unclear. Here we use integrated ChIP-seq, ATAC-seq and RNA-seq on patient-derived, subclonal and CRISPR-Cas9-KD DIPG cells to show that loss of KMT5B/C causes depletion of these retained H3K27me3 loci via changes in chromatin accessibility, causing a raft of transcriptional changes which promote tumorigenesis. De-repression occurred at bivalent loci marked by H3K4me3, driving increased transcriptional heterogeneity and elevated gene expression associated with increased invasion, abrogated DNA repair and mesenchymal transition, along with a markedly altered secretome. These data suggest a previously unrecognised trans-histone (H4/H3) interaction in DIPG cells with a potentially profound effect on their diffusely infiltrating phenotype.