Abstract Chromatin organization over a wide range of length scales plays a critical role in the regulation of transcription and deciphering the interplay of these processes requires high-resolution, three-dimensional, quantitative imaging of chromatin structure in vitro . Herein, we introduce ChromSTEM, a method that utilizes high angle annular dark-field imaging and tomography in scanning transmission electron microscopy combined with DNA-specific staining for electron microscopy. We utilized ChromSTEM to quantify chromatin structure in cultured cells and the statistical packing behavior of the chromatin polymer. Using chromatin mass and density analysis, we observed that chromatin forms spatially well-defined higher-order domains which are around 100 nm in radius, with a radially decreasing mass-density from the center to the periphery. Although the morphological properties of the domains vary within the same cell line, they seem to exhibit greater heterogeneity across cell lines, underlying a potential role of statistical chromatin packing in regulating cell-type-specific gene expression.

Abstract With the textbook view of chromatin folding based on the 30nm fiber being challenged, it has been proposed that interphase DNA has an irregular 10nm nucleosome polymer structure whose folding philosophy is unknown. Nevertheless, experimental advances suggested that such irregular packing is associated with many nontrivial physical properties that are puzzling from a polymer physics point of view. Here, we show that the reconciliation of these exotic properties necessitates modularizing 3D genome into tree data structures on top of, and in striking contrast to the linear topology of DNA double helix. Such functional modules need to be connected and isolated by an open backbone that results in porous and heterogeneous packing in a quasi-self-similar manner as revealed by our electron and optical imaging. Our multi-scale theoretical and experimental results suggest the existence of higher-order universal folding principles for a disordered chromatin fiber to avoid entanglement and fulfill its biological functions.

In eukaryotic cells, chromatin structure is linked to transcription processes through the regulation of genome organization. Extending across multiple length-scales - from the nucleosome to higher-order three-dimensional structures - chromatin is a dynamic system which evolves throughout the lifetime of a cell. However, no individual technique can fully elucidate the behavior of chromatin organization and its relation to molecular function at all length- and timescales at both a single-cell and a cell population level. Herein, we present a multi-technique nanoscale Chromatin Imaging and Analysis (nano-ChIA) platform that bridges electron tomography and optical superresolution imaging of chromatin conformation and transcriptional processes, with resolution down to the level of individual nucleosomes, with high-throughput, label-free analysis of chromatin packing and its dynamics in live cells. Utilizing nano-ChIA, we observed that chromatin is localized into spatially separable packing domains, with an average diameter of around 200 nm, sub-Mb genomic size, and an internal fractal structure. The chromatin packing behavior of these domains is directly influenced by active gene transcription. Furthermore, we demonstrated that the chromatin packing domain structure is correlated among progenitor cells and all their progeny, indicating that the organization of chromatin into fractal packing domains is heritable across cell division. Further studies employing the nano-ChIA platform have the potential to provide a more coherent picture of chromatin structure and its relation to molecular function.

Chromatin organization over a wide range of length scales plays a critical role in the regulation of gene expression and deciphering these processes requires high-resolution, three-dimensional, quantitative imaging of chromatin structure in vitro. Herein we introduce ChromSTEM, a method which utilizes high angle annular dark field imaging and tomography in scanning transmission electron microscopy in combination with DNA-specific staining for electron microscopy. We utilized ChromSTEM to quantify chromatin structure in cultured cells and tissue biopsies through local DNA distribution and the scaling behavior of chromatin polymer. We observed that chromatin is densely packed with an average volume concentration of over 30% with heterochromatin having a two-fold higher density compared to euchromatin. Chromatin was arranged into spatially well-defined nanoscale packing domains with fractal internal structure and genomic size between 100 and 400 kb, comparable to that of topologically associated domains. The packing domains varied in DNA concentration and fractal dimension and had one of the distinct states of chromatin packing with differential ratio of DNA content to the chromatin volume concentration. Finally, we observed a significant intercellular heterogeneity of chromatin organization even within a genetically uniform cell population, which demonstrates the imperative for high-throughput characterization of chromatin structure at the single cell level.

We present a multimodal label-free interferometric imaging platform for measuring intracellular nanoscale structure and macromolecular dynamics in living cells with a sensitivity to macromolecules as small as 20nm and millisecond temporal resolution. We validate this system by pairing experimental measurements of nanosphere phantoms with a novel interferometric theory. Applying this system in vitro, we explore changes in higher-order chromatin structure and dynamics that occur due to cellular fixation, stem cell differentiation, and ultraviolet (UV) light irradiation. Finally, we discover a new phenomenon, cellular paroxysm, a near-instantaneous, synchronous burst of motion that occurs early in the process of UV induced cell death. Given this platforms ability to obtain nanoscale sensitive, millisecond resolved information within live cells without concerns of photobleaching, it has the potential to answer a broad range of critical biological questions about macromolecular behavior in live cells, particularly about the relationship between cellular structure and function.

Transformation in chromatin organization is one of the most universal markers of carcinogenesis. Microscale chromatin alterations have been a staple of histopathological diagnosis of neoplasia, and nanoscale alterations have emerged as a promising marker for cancer prognostication and the detection of predysplastic changes. While numerous methods have been developed to detect these alterations, most methods for sample preparation remain largely validated via conventional microscopy, and have not been examined with nanoscale sensitive imaging techniques. For these nanoscale sensitive techniques to become standard of care screening tools, new histological protocols must be developed that preserve nanoscale information. Partial Wave Spectroscopic (PWS) microscopy has recently emerged as a novel imaging technique sensitive to length scales ranging between 20 and 200 nanometers. As a label-free, high-throughput, and non-invasive imaging technique, PWS microscopy offers many advantages for risk stratification of early cancer, and is an ideal tool to quantify structural information during sample preparation. Therefore, in this work we applied PWS microscopy to systematically evaluate the effects of cytological preparation on the nanoscales changes of chromatin using two cell line models: Hela cells differentially treated with daunorubicin and TP53 differentially mutated ovarian carcinoma cells. Notably, we show that existing cytological preparation can be modified in order to maintain clinically relevant nanoscopic differences, paving the way for the emerging field of nanopathology.