To take advantage of affordable high-throughput next-generation sequencing technologies to characterize microbial community composition often requires the development of improved methods to overcome technical limitations inherent to the sequencing platforms. Sequencing low sequence diversity libraries such as 16S rRNA amplicons has been problematic on the Illumina MiSeq platform and often generates sequences of suboptimal quality.Here we present an improved dual-indexing amplification and sequencing approach to assess the composition of microbial communities from clinical samples using the V3-V4 region of the 16S rRNA gene on the Illumina MiSeq platform. We introduced a 0 to 7 bp "heterogeneity spacer" to the index sequence that allows an equal proportion of samples to be sequenced out of phase.Our approach yields high quality sequence data from 16S rRNA gene amplicons using both 250 bp and 300 bp paired-end MiSeq protocols and provides a flexible and cost-effective sequencing option.

Pectobacterium and Dickeya spp. are related broad-host-range entero-bacterial pathogens of angiosperms. A review of the literature shows that these genera each cause disease in species from at least 35% of angiosperm plant orders. The known host ranges of these pathogens partially overlap and, together, these two genera are pathogens of species from 50% of angiosperm plant orders. Notably, there are no reported hosts for either genus in the eudicots clade and no reported Dickeya hosts in the magnoliids or eurosids II clades, although Pectobacterium spp. are pathogens of at least one plant species in the magnoliids and at least one in each of the three eurosids II plant orders. In addition, Dickeya but not Pectobacterium spp. have been reported on a host in the rosids clade and, unlike Pectobacterium spp., have been reported on many Poales species. Natural disease among nonangiosperms has not been reported for either genus. Phylogenetic analyses of sequences concatenated from regions of seven housekeeping genes (acnA, gapA, icdA, mdh, mtlD, pgi, and proA) from representatives of these genera demonstrated that Dickeya spp. and the related tree pathogens, the genus Brenneria, are more diverse than Pectobacterium spp. and that the Pectobacterium strains can be divided into at least five distinct clades, three of which contain strains from multiple host plants.

In order for human microbiome studies to translate into actionable outcomes for health, meta-analysis of reproducible data from population-scale cohorts is needed. Achieving sufficient reproducibility in microbiome research has proven challenging. We report a baseline investigation of variability in taxonomic profiling for the Microbiome Quality Control (MBQC) project baseline study (MBQC-base). Blinded specimen sets from human stool, chemostats, and artificial microbial communities were sequenced by 15 laboratories and analyzed using nine bioinformatics protocols. Variability depended most on biospecimen type and origin, followed by DNA extraction, sample handling environment, and bioinformatics. Analysis of artificial community specimens revealed differences in extraction efficiency and bioinformatic classification. These results may guide researchers in experimental design choices for gut microbiome studies.

Halite endoliths in the Atacama Desert represent one of the most extreme microbial ecosystems on Earth. Here we sequenced and characterized a shotgun metagenome from halite nodules collected in Salar Grande, Chile. The community is dominated by archaea and functional analysis attributed most of the autotrophic CO2 fixation to a unique cyanobacterium. The assembled 1.1 Mbp genome of a novel nanohaloarchaeon, Candidatus Nanopetramus SG9, revealed a photoheterotrophic life style and a low median isoelectric point (pI) for all predicted proteins, suggesting a "salt-in" strategy for osmotic balance. Predicted proteins of the algae identified in the community also had pI distributions similar to "salt-in" strategists. The Nanopetramus genome contained a unique CRISPR/Cas system with a spacer that matched a partial viral genome from the metagenome. A combination of reference-independent methods identified over 30 complete or near complete viral or proviral genomes with diverse genome structure, genome size, gene content, and hosts. Putative hosts included Halobacteriaceae, Nanohaloarchaea, and Cyanobacteria. Despite the dependence of the halite community on deliquescence for liquid water availability, this study exposed an ecosystem spanning three phylogenetic domains, containing a large diversity of viruses, and a predominant salt-in strategy to balance the high osmotic pressure of the environment.

Abstract Vaginal bacterial communities dominated by Lactobacillus species are associated with a reduced risk to various adverse health outcomes. However, somewhat unexpectedly many healthy women have microbiota that are not dominated by lactobacilli. To determine the factors that drive vaginal community composition we characterized the genetic composition and transcriptional activities of vaginal microbiota in healthy women. We demonstrated that the abundance of a species is not always indicative of its transcriptional activity and that impending changes in community composition can be predicted from metatranscriptomic data. Functional comparisons highlight differences in the metabolic activities of these communities, notably in their degradation of host-produced mucin but not glycogen. Degradation of mucin by communities not dominated by Lactobacillus may play a role in their association with adverse health outcomes. Finally, we show that the transcriptional activities of L. crispatus, L. iners , and G. vaginalis vary with the taxonomic composition of the communities in which they reside. Notably, L. iners and G. vaginalis both demonstrated lower expression of their cholesterol-dependent cytolysins when co-resident with Lactobacillus spp. and higher expression when co-resident with other facultative and obligate anaerobes. The pathogenic potential of these species may depend on the communities in which they reside and thus could be modulated by interventional strategies. Our results provide insight to the functional ecology of vaginal microbiota and reveal strategies for management of these ecosystems.

Abstract Background Analysis of metagenomic and metatranscriptomic data is complicated and typically requires extensive computational resources. Leveraging a curated reference database of genes encoded by members of the target microbiome can make these analyses more tractable. Unfortunately, there is no such reference database available for the vaginal microbiome. Results In this study, we assembled a comprehensive human vaginal non-redundant gene catalog (VIRGO) from 264 vaginal metagenomes and 416 genomes of urogenital bacterial isolates. VIRGO includes 0.95 million non-redundant genes compiled from a total of 5.5 million genes belonging to 318 unique bacterial species. We show that VIRGO covers more than 95% of the vaginal bacterial gene content in metagenomes from North American, African, and Chinese women. The gene catalog was extensively functionally annotated from 17 diverse protein databases, and importantly taxonomy was assigned through in silico binning of genes derived from metagenomic assemblies. To further enable focused analyses of individual genes and proteins, we also clustered the non-redundant genes into vaginal orthologous groups (VOG). The gene-centric design of VIRGO and VOG provides an easily accessible tool to comprehensively characterize the structure and function of vaginal metagenome and metatranscriptome datasets. To highlight the utility of VIRGO, we analyzed 1,507 additional vaginal metagenomes, uncovering an as of yet undetected high degree of intraspecies diversity within and across vaginal microbiota. Conclusions VIRGO offers a convenient reference database and toolkit that will facilitate a more in-depth understanding of the role of vaginal microorganisms in women’s health and reproductive outcomes.

Abstract It is not clear if the bacterial strains which comprise our microbiota are mostly long-term colonizers or transient residents. Studies have demonstrated decades long persistence of bacterial strains within the gut, but persistence at other body sites has yet to be determined. The vaginal microbiota (VMB) is often dominated by Lactobacillus , although it is also commonly comprised of a more diverse set of other facultative and obligate anaerobes. Longitudinal studies have demonstrated that these communities can be stable over several menstrual cycles or can fluctuate temporally in species composition. We sought to determine whether the bacterial strains which comprise the VMB were capable of persisting over longer time-periods. We performed shotgun metagenomics on paired samples from 10 participants collected 1 and 2 years apart. The resulting sequences were de novo assembled and binned into high-quality metagenome assembled genomes. Persistent strains were identified based on the sequence similarity between the genomes present at the two timepoints and were found in the VMB of six of the participants, three of which had multiple. The VMB of the remaining four participants was similar in species composition at the two timepoints but was comprised of different strains. For the persistent strains, we were able to identify the mutations which fixed in the populations over the observed time period, giving insight into the evolution of these bacteria. These results indicate that bacterial strains can persist in the vagina for extended periods of time, providing an opportunity for them to evolve in the host microenvironment. Importance The persistence of strains within the vaginal microbiota has not yet been characterized. Should these strains be capable of persisting for extended periods of time, they could evolve within their host in response to selective pressures exerted by the host or by other members of the community. Here, we present preliminary findings which demonstrate that bacterial strains can persist in the vagina for at least one year and evolve over time. In several cases, multiple strains persisted together in a community, indicating that co-evolution between bacterial strains could occur in the vagina. Our observations motivate future studies which collect samples from more participants, at more timepoints and over even longer periods of time. Understanding which strains persist, what factors drive their persistence, and what selective pressures they face will inform the development and delivery of rationally designed live biotherapeutics for the vagina.

ABSTRACT “Leaky gut”, or high intestinal barrier permeability, is common in preterm newborns. The role of microbiota in this process remains largely uncharacterized. We employed both short- and long-read sequencing of the 16S rRNA gene and metagenomes to characterize the intestinal microbiome of a longitudinal cohort of 113 preterm infants born between 24 0/7 -32 6/7 weeks of gestation. Enabled by enhanced taxonomic resolution, we found significantly increased abundance of Bifidobacterium breve and a diet rich in mother’s breastmilk to be associated with intestinal barrier maturation during the first week of life. We combined these factors using genome- resolved metagenomics and identified a highly specialized genetic capability of the Bifidobacterium strains to assimilate human milk oligosaccharides and host-derived glycoproteins. Our study proposed mechanistic roles of breastmilk feeding and intestinal microbial colonization in postnatal intestinal barrier maturation; these observations are critical towards advancing therapeutics to prevent and treat hyperpermeable gut- associated conditions, including necrotizing enterocolitis. IMPORTANCE Despite improvements in neonatal intensive care, necrotizing enterocolitis (NEC) remains a leading cause of morbidity and mortality. “Leaky gut”, or intestinal barrier immaturity with elevated intestinal permeability, is the proximate cause of susceptibility to NEC. Early detection and intervention to prevent leaky gut in “at-risk” preterm neonates is critical to lower the risk for potentially life-threatening complications like NEC. However, the complex interactions between the developing gut microbial community, nutrition, and intestinal barrier function, remain largely uncharacterized. In this study, we revealed the critical role of sufficient breastmilk feeding volume and specialized carbohydrate metabolism capability of Bifidobacterium in coordinated postnatal improvement of intestinal barrier. Determining the clinical and microbial biomarkers that drive the intestinal developmental disparity will inform early detection and novel therapeutic strategies to promote appropriate intestinal barrier maturation, prevent NEC and other adverse health conditions in preterm infants.

ABSTRACT The beneficial effects attributed to Bifidobacterium are thought to arise from their host immunomodulatory capabilities, which are likely to be species- and even strain-specific. However, their strain-specificity in direct and indirect immune modulation remain largely uncharacterized. We have shown that B. pseudolongum UMB-MBP-01, a murine isolate, is capable of suppressing inflammation and reducing fibrosis in vivo . To ascertain the mechanism driving this activity and to determine if it is specific to UMB-MBP-01, we compared it to B. pseudolongum type strain ATCC25526 of porcine origin using a combination of in vitro and in vivo experimentation and comparative genomics approaches. Despite many shared features, we demonstrate that these two strains possess distinct genetic repertoires in carbohydrate assimilation, differential activation signatures and cytokine responses in innate immune cells, and differential effects on lymph node morphology with unique local and systemic leukocyte distribution. Importantly, the administration of each B. pseudolongum strain resulted in major divergence in the structure, composition, and function of gut microbiota. This was accompanied by markedly different changes in intestinal transcriptional activities, suggesting strain-specific modulation of the endogenous gut microbiota as a key to host responses of immune modulation and changes in intestinal B. pseudolongum strains. These observations highlight the importance of strain-specificity characteristics of Bifidobacterium for prophylactic supplementation for immune modulation and advance our understanding of the mechanisms which drive the association between Bifidobacterium and health benefit.

ABSTRACT Background Despite ongoing improvements in regimens to prevent allograft rejection, most cardiac and other organ grafts eventually succumb to chronic vasculopathy, interstitial fibrosis, or endothelial changes, and eventually graft failure. The events leading to chronic rejection are still poorly understood and the gut microbiota is a known driving force in immune dysfunction. We previously showed that gut microbiota dysbiosis profoundly influences the outcome of vascularized cardiac allografts and subsequently identified biomarker species associated with these differential graft outcomes. Methods In this study, we further detailed the multifaceted immunomodulatory properties of pro-tolerogenic and pro-inflammatory bacterial species over time, using our clinically relevant model of allogenic heart transplantation. Results In addition to tracing longitudinal changes in the recipient gut microbiome over time, we observed that Bifidobacterium pseudolongum (Bifido) induced an early anti-inflammatory phenotype within 7 days, while Desulfovibrio desulfuricans (Desulfo) resulted in a pro-inflammatory phenotype, defined by alterations in leukocyte distribution and lymph node (LN) structure. Indeed, in vitro results showed that Bifido and Desulfo acted directly on primary innate immune cells. However, by 40 days after treatment, these two bacterial strains were associated with mixed effects in their impact on LN architecture and immune cell composition and loss of colonization within gut microbiota, despite protection of allografts from inflammation with Bifido treatment. Conclusions These dynamic effects suggest a critical role for early microbiota-triggered immunological events such as innate immune cell engagement, T cell differentiation, and LN architectural changes in the subsequent modulation of pro-tolerant versus pro-inflammatory immune responses in organ transplant recipients.