Abstract The last eukaryote common ancestor (LECA) lived 1.6 billion years ago 1,2 . It possessed nuclei, sex, an endomembrane system, mitochondria, and all key traits that make eukaryotic cells more complex than their prokaryotic ancestors 2–6 . The closest known relatives of the host lineage that acquired the mitochondrion are, however, small obligately symbiotic archaea that lack any semblance of eukaryotic cell complexity 7 . Although the steep evolutionary grade separating prokaryotes from eukaryotes increasingly implicates mitochondrial symbiosis at eukaryote origin 4,7 , the timing and evolutionary significance of mitochondrial origin remains debated. Gradualist theories contend that eukaryotes arose from archaea by slow accumulation of eukaryotic traits 8–10 with mitochondria arriving late 11 , while symbiotic theories have it that mitochondria initiated the onset of eukaryote complexity in a non-nucleated archaeal host 7 by gene transfers from the organelle 4,12–14 . The evolutionary process leading to LECA should be recorded in its gene duplications. Among 163,545 duplications in 24,571 gene trees spanning 150 sequenced eukaryotic genomes we identified 713 gene duplication events that occurred in LECA. LECA’s bacterially derived genes were duplicated more frequently than archaeal derived or eukaryote specific genes, reflecting the serial copying 15,16 of genes from the mitochondrial endosymbiont to the archaeal host’s chromosomes prior to the onset of eukaryote genome complexity. Bacterial derived genes for mitochondrial functions, lipid synthesis, biosynthesis, as well as core carbon and energy metabolism in LECA were duplicated more often than archaeal derived genes and even more often than eukaryote-specific inventions for endomembrane, cytoskeletal or cell cycle functions. Gene duplications record the sequence of events at LECA’s origin and indicate that recurrent gene transfer from a resident mitochondrial endosymbiont preceded the onset of eukaryotic cellular complexity.

Abstract Pittis and Gabaldón 1 recently claimed that the mitochondrion came late in eukaryotic evolution, following an earlier phase of evolution in which the eukaryotic host lineage acquired genes from bacteria. Here we show that their paper has multiple fatal flaws founded in inappropriate statistical methods and analyses, in addition to erroneous interpretations.

Abstract Two multisubunit protein complexes for membrane protein insertion were recently identified in the endoplasmic reticulum (ER): The guided entry of tail anchor proteins (GET) complex and ER membrane complex (EMC). The structures of both of their hydrophobic core subunits, that are required for the insertion reaction, revealed an overall similarity to the YidC/Oxa1/Alb3 family members found in bacteria, mitochondria and chloroplasts. This suggests that these membrane insertion machineries all share a common ancestry. To test whether these ER proteins can functionally replace Oxa1 in yeast mitochondria, we generated strains that express mitochondria-targeted Get2-Get1 and Emc6-Emc3 fusion proteins in Oxa1 deletion mutants. Interestingly, the Emc6-Emc3 fusion was able to complement an Δoxa1 mutant and restored its respiratory competence. The Emc6-Emc3 fusion promoted the insertion of the mitochondrially encoded protein Cox2 as well as of nuclear encoded inner membrane proteins though was not able to facilitate the assembly of the Atp9 ring. Our observations indicate that protein insertion into the ER is functionally conserved to the insertion mechanism in bacteria and mitochondria and adheres to similar topological principles.

It is well accepted that mitochondria originated from an alphaproteobacterial-like ancestor. However, the phylogenetic relationship of the mitochondrial endosymbiont to extant alphaproteobacteria remains a subject of discussion. The focus of much debate is whether the affiliation between mitochondria and fast-evolving alphaproteobacterial lineages reflects true homology or artifacts. Approaches such as protein-recoding and site-exclusion have been claimed to mitigate compositional heterogeneity between taxa but this comes at the cost of information loss and the reliability of such methods is so far unjustified. Here we demonstrate that site-exclusion methods produce erratic phylogenetic estimates of mitochondrial origin. We applied alternative strategies to reduce phylogenetic noise by taxon replacement and selective exclusion while keeping site substitution information intact. Cross-validation based on a series of trees placed mitochondria robustly within Alphaproteobacteria.

Sequence-based maximum likelihood (ML) phylogenetics is a widely used method for inferring evolutionary relationships, which has illuminated the evolutionary histories of proteins and the organisms that harbour them. But modern implementations with sophisticated models of sequence evolution struggle to resolve deep evolutionary relationships, which can be obscured by excessive sequence divergence and substitution saturation. Structural phylogenetics has emerged as a promising alternative, because protein structure evolves much more slowly than protein sequences. Recent developments protein in structure prediction using AI have made it possible to predict protein structures for entire protein families, and then to translate these structures into a sequence representation - the 3Di structural alphabet - that can in theory be directly fed into existing sequence based phylogenetic software. To unlock the full potential of this idea, however, requires the inference of a general substitution matrix for structural phylogenetics, which has so far been missing. Here we infer this matrix from large datasets of protein structures and show that it results in a better fit to empirical datasets that previous approaches. We then use this matrix to re-visit the question of the root of the tree of life. Using structural phylogenies of universal paralogs, we provide the first unambiguous evidence for a root between and archaea and bacteria. Finally, we discuss some practical and conceptual limitations of structural phylogenetics. Our 3Di substitution matrix provides a starting point for revisiting many deep phylogenetic problems that have so far been extremely difficult to solve.

Metagenomic studies have claimed the existence of novel lineages with unprecedented properties never before observed in prokaryotes. Such lineages include Asgard archaea, which are claimed to represent archaea with eukaryotic cell complexity, and the Candidate Phyla Radiation (CPR), a novel domain level taxon erected solely on the basis of metagenomic data. However, it has escaped the attention of most biologists that these metagenomic sequences are not assembled into genomes by sequence overlap, as for cultured archaea and bacteria. Instead, short contigs are sorted into computer files by a process called binning in which they receive taxonomic assignment on the basis of sequence properties like GC content, dinucleotide frequencies, and stoichiometric co-occurrence across samples. Consequently, they are not genome sequences as we know them, reflecting the gene content of real organisms. Rather they are metagenome assembled genomes (MAGs). Debates that Asgard data are contaminated with individual eukaryotic sequences are overshadowed by the more pressing issue that no evidence exists to indicate that any sequences in binned Asgard MAGs actually stem from the same chromosome, as opposed to simply stemming from the same environment. Here we show that Asgard and CPR MAGs fail spectacularly to meet the most basic phylogenetic criterion fulfilled by genome sequences of all cultured prokaryotes investigated to date: the ribosomal proteins of Asgard and CPR MAGs do not share common evolutionary histories. Their phylogenetic behavior is anomalous to a degree never observed with genomes of real organisms. CPR and Asgard MAGs are binning artefacts, assembled from environments where up to 90% of the DNA is from dead cells. Asgard and CPR MAGs are unnatural constructs, genome-like patchworks of genes that have been stitched together into computer files by binning.

One hurdle to understanding how molecular machines function and evolve is our inability to see their structures in situ. Here we describe a minicell system that enables in situ cryogenic electron microscopy imaging and single particle analysis to probe the mechanisms and evolution of an iconic molecular machine, the bacterial flagellar motor, which spins a helical propeller for bacterial propulsion. Innovations in sample preparation and imaging enabled resolutions sufficient to build an in situ molecular model of the C. jejuni flagellar motor. Our results provide unprecedented insights into the in situ context of flagellar motors, highlight origins of recruited components involved in the unusually high torque of the C. jejuni motor, identify previously unknown components, and reveal corresponding modifications of core components. We also visualise structures involved in torque generation and secretion previously recalcitrant to structure determination. This technique will be of broad applicability to other large membrane-residing protein complexes. Note that this manuscript has a sibling manuscript titled "Evolution of a large periplasmic disk in Campylobacterota flagella facilitated efficient motility alongside autoagglutination" that dissects the function of the large disk described in this manuscript.

Pyruvate:ferredoxin oxidoreductase (PFO) and iron only hydrogenase ([Fe]-HYD) are common enzymes among eukaryotic microbes that inhabit anaerobic niches. Their function is to maintain redox balance by donating electrons from food oxidation via ferredoxin (Fd) to protons, generating H2 as a waste product. Operating in series, they constitute a soluble electron transport chain of one-electron transfers between FeS clusters. They fulfill the same function - redox balance - served by two electron-transfers in the NADH- and O2-dependent respiratory chains of mitochondria. Although they possess O2-sensitive FeS clusters, PFO, Fd and [Fe]-HYD are also present among numerous algae that produce O2. The evolutionary persistence of these enzymes among eukaryotic aerobes is traditionally explained as enabling facultative anaerobic growth. Here we show that algae express enzymes of anaerobic energy metabolism at ambient O2 levels (21% v/v), Chlamydomonas reinhardtii expresses them with diurnal regulation. High O2 environments arose on Earth only some ~450 million years ago. Gene presence absence and gene expression data indicate that during the transition to high O2 environments and terrestrialization, diverse algal lineages retained enzymes of Fd-dependent one-electron based redox balance, while the land plant and land animal lineages underwent irreversible specialization to redox balance involving the O2-insensitive two-electron carrier NADH.

Significance Statement Ever since the first report of a new archaeal lineage, the asgardarchaea, their metagenome analyses have encouraged continued speculations on a type of cell biology ranging between that of prokaryotes and eukaryotes. While it appears a tempting notion, recent microscopic images of an asgardarchaeon suggest otherwise. We inspected the origin of eukaryotic protein families with respect to their distribution across bacteria and archaea. This reveals that the protein families shared exclusively between asgardarchaea and eukaryotes amounts to only 0.3% of the protein families conserved across all eukaryotes. Asgardarchaeal diversity is likely unrivaled across archaea, but their cell biology remains prokaryotic in nature and lends support for the importance of endosymbiosis in evolving eukaryotic traits. Summary The difference between pro- and eukaryotic biology is evident in their genomes, cell biology, and evolution of complex and macroscopic body plans. The lack of intermediates between the two types of cells places the endosymbiotic acquisition of the mitochondrion through an archaeal host at the event horizon of eukaryote origin. The identification of eukaryote specific proteins in a new archaeal phylum, the asgardarchaea, has fueled speculations about their cellular complexity, suggesting they could be eukaryote-like. Here we analyzed the coding capacity of 150 eukaryotes, 1000 bacteria, and 226 archaea, including the only cultured member of the asgardarchaea, Candidatus Prometheoarchaeon syntrophicum MK-D1. Established clustering methods that recover endosymbiotic contributions to eukaryotic genomes, recover an asgardarchaeal-unique contribution of a mere 0.3% to protein families present in the last eukaryotic common ancestor, while simultaneously suggesting that asgardarchaeal diversity rivals that of all other archaea combined. Furthermore, we show that the number of homologs shared exclusively between asgardarchaea and eukaryotes is only 27 on average. Genomic and in particular cellular complexity remains a eukaryote-specific feature and, we conclude, is best understood as the archaeal host’s solution to housing an endosymbiont and not as a preparation for obtaining one.

Trichomonas vaginalis is one of the most widespread, sexually transmitted pathogens. The infection involves a morphological switch from a free-swimming pyriform trophozoite to an amoeboid cell upon adhesion to host epithelial cells. While details on how the switch is induced and to what proteins of the host surface the parasite adheres remain poorly characterized, several surface proteins of the parasite itself have been identified as potential candidates. Among those are two expanded protein families that harbor domains that share similarity to functionally investigated surface proteins of prokaryotic oral pathogens; these are the BspA proteins of Bacteroidales and Spirochaetales, and the Pmp proteins of Chlamydiales. We sequenced the transcriptomes of five Trichomonads and screened for the presence of BspA and Pmp domain-containing proteins and tested the ability of individual T. vaginalis candidates to mediate adhesion. Here we demonstrate that (i) BspA and Pmp domain-containing proteins are specifically expanded in T. vaginalis in comparison to other Trichomonads, and that (ii) individual proteins of both families have the ability to increase adhesion performance in a non-virulent T. vaginalis strain and Tetratrichomonas gallinarum, a parasite usually known to infect birds but not humans. Our results initiate the functional characterization of these two broadly distributed protein families, whose origin we trace back to the origin of Trichomonads themselves.