Abstract Uterine leiomyoma or fibroids are prevalent noncancerous tumors of the uterine muscle layer, yet their origin and development remain poorly understood. We analyzed RNA expression profiles of 15 epigenetic mediators in uterine fibroids compared to myometrium using publicly available RNA sequencing (RNA-seq) data. To validate our findings, we performed RT-qPCR on a separate cohort of uterine fibroids targeting these modifiers confirming our RNA-seq data. We then examined protein profiles of key N6-methyladenosine (m6A) modifiers in fibroids and their matched myometrium, showing no significant differences in concordance with our RNA expression profiles. To determine RNA modification abundance, mRNA and small RNA from fibroids and matched myometrium were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry identifying prevalent m6A and 11 other known modifiers. However, no aberrant expression in fibroids was detected. We then mined a previously published dataset and identified differential expression of m6A modifiers that were specific to fibroid genetic subtype. Our analysis also identified m6A consensus motifs on genes previously identified to be dysregulated in uterine fibroids. Overall, using state-of-the-art mass spectrometry, RNA expression, and protein profiles, we characterized and identified differentially expressed m6A modifiers in relation to driver mutations. Despite the use of several different approaches, we identified limited differential expression of RNA modifiers and associated modifications in uterine fibroids. However, considering the highly heterogenous genomic and cellular nature of fibroids, and the possible contribution of single molecule m6A modifications to fibroid pathology, there is a need for greater in-depth characterization of m6A marks and modifiers in a larger and diverse patient cohort.

Acyl-CoA/protein interactions are required for many functions essential to life including membrane synthesis, oxidative metabolism, and macromolecular acetylation. However, despite their importance, the global scope and selectivity of these protein-metabolite interactions remains undefined. Here we describe the development of CATNIP (CoA/AcetylTraNsferase Interaction Profiling), a chemoproteomic platform for the high-throughput analysis of acyl-CoA/protein interactions in endogenous proteomes. First, we apply CATNIP to identify acetyl-CoA-binding proteins through unbiased clustering of competitive dose-response data. Next, we use this method to profile diverse protein-CoA metabolite interactions, identifying biological processes susceptible to altered acetyl-CoA levels. Finally, we apply systems-level analyses to assess the features of novel protein networks that may interact with acyl-CoAs, and demonstrate a strategy for high-confidence proteomic annotation of acetyl-CoA binding proteins. Overall our studies illustrate the power of integrating chemoproteomics and systems biology, and provide a resource for understanding the roles of acyl-CoA metabolites in biology and disease.

Chemical modifications of RNAs have long been appreciated as key modulators of non-coding RNA structure and function. There is an emerging realization that chemical modification of protein-coding mRNAs also plays critical roles in the cell. Nonetheless, of the over 100 known RNA modifications found in biology only a handful have been identified in mRNAs. Here we use an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) method to identify and quantify modifications present in mRNAs of yeast cells. We detect the presence of four modified nucleosides in mRNAs at relatively high abundances: N7-methylguanosine, N6-methyladenosine, N4-acetylcytidine and 5-formylcytidine. Additionally, we investigate how the levels of mRNA modifications change in response to cellular stress. We find that the concentrations of ten mRNA modifications including N6-methyladenosine and N4-acetylcytidine change in response to heat stress, glucose starvation and/or oxidative stress. Our findings suggest that mRNA modification may provide a potential mechanism for cells to rapidly respond to environmental stressors.

Abstract Uterine leiomyoma or fibroids are the most common prevalent noncancerous tumors of the uterine muscle layer. Common symptoms associated with fibroids include pelvic pain, heavy menstrual bleeding, anemia, and pelvic pressure. These tumors are a leading cause of gynecological care but lack long-term therapy as the origin and development of fibroids are not well understood. Several next-generation sequencing technologies have been performed to identify the underlying genetic and epigenetic basis of fibroids. However, there remains a systemic gap in our understanding of molecular and biological process that define uterine fibroids. Recent epitranscriptomics studies have unraveled RNA modifications that are associated with all forms of RNA and are thought to influence both normal physiological functions and the progression of diseases. We quantified RNA expression profiles by analyzing publicly available RNA-seq data for 15 known epigenetic mediators to identify their expression profile in uterine fibroids compared to myometrium. To validate our findings, we performed RT-qPCR on a separate cohort of uterine fibroids targeting these modifiers confirming our RNA-seq data. We then examined protein profiles of key m 6 A modifiers in fibroids and their matched myometrium. In concordance with our RNA expression profiles, no significant differences were observed in these proteins in uterine fibroids compared to myometrium. To determine abundance of RNA modifications, mRNA and small RNA from fibroids and matched myometrium were analyzed by UHPLC MS/MS. In addition to the prevalent N6-methyladenosine (m 6 A), we identified 11 other known modifiers but did not identify any aberrant expression in fibroids. We then mined a previously published dataset and identified differential expression of m 6 A modifiers that were specific to fibroid genetic sub-type. Our analysis also identified m 6 A consensus motifs on genes previously identified to be dysregulated in uterine fibroids. Overall, using state-of-the-art mass spectrometry, RNA expression and protein profiles, we characterized and identified differentially expressed m 6 A modifiers in relation to driver mutations. Despite the use of several different approaches, we identified limited differential expression of RNA modifiers and associated modifications in uterine fibroids. However, considering the highly heterogenous genomic and cellular nature of fibroids, and the possible contribution of single molecule m 6 A modifications to fibroid pathology, there is a need for greater in-depth characterization of m 6 A marks and modifiers in a larger and varied patient cohort.

Abstract Thirty percent of all mutations causing human diseases generate mRNAs with premature termination codons (PTCs). Recognition and degradation of these PTC-containing mRNAs is carried out by the mechanism known as nonsense-mediated mRNA decay (NMD). Upf2 is a scaffold protein known to be a central component of the NMD surveillance pathway. It harbors three middle domain of eukaryotic initiation factor 4G (mIF4G) domains in its N-terminal potentially important in regulating the surveillance pathway. In this study, we defined regions within the mIF4G-1 and mIF4G-2 that are required for proper function of NMD and translation termination in Saccharomyces cerevisiae Upf2. In addition, we narrowed down the activity of these regions to an aspartic acid (D59) in mIF4G-1 which is important for NMD activity and translation termination accuracy. Taken together, these studies suggest that inherent charged residues within mIF4G-1 of Upf2 play a role in the regulation of the NMD surveillance mechanism in S. cerevisiae .

Abstract Epitranscriptomic marks, in the form of enzyme catalyzed RNA modifications, play important gene regulatory roles in response to environmental and physiological conditions. However, little is known with respect to how pharmaceuticals influence the epitranscriptome. Here we define how acetaminophen (APAP) induces epitranscriptomic reprogramming and how the writer Alkylation Repair Homolog 8 (Alkbh8) plays a key gene regulatory role in the response. Alkbh8 modifies tRNA selenocysteine (tRNA Sec ) to translationally regulate the production of glutathione peroxidases (Gpx’s) and other selenoproteins, with Gpx enzymes known to play protective roles during APAP toxicity. We demonstrate that APAP increases toxicity and markers of damage, and decreases selenoprotein levels in Alkbh8 deficient mouse livers, when compared to wildtype. APAP also promotes large scale reprogramming of 31 RNA marks comprising the liver tRNA epitranscriptome including: 5-methoxycarbonylmethyluridine (mcm 5 U), isopentenyladenosine (i 6 A), pseudouridine (Ψ), and 1-methyladenosine (m 1 A) modifications linked to tRNA Sec and many others. Alkbh8 deficiency also leads to wide-spread epitranscriptomic dysregulation in response to APAP, demonstrating that a single writer defect can promote downstream changes to a large spectrum of RNA modifications. Our study highlights the importance of RNA modifications and translational responses to APAP, identifies writers as key modulators of stress responses in vivo and supports the idea that the epitranscriptome may play important roles in responses to pharmaceuticals.

Abstract A fundamental facet of cell signaling is the conversion of extracellular signals into adaptive transcriptional responses. The role of RNA modifications in this process is poorly understood. The small nuclear RNA 7SK prevents transcription elongation by sequestering the complex CDK9/CCNT1 (P-TEFb). We discovered that METTL3 methylates 7SK. The m 6 A methylation of 7SK in turn promotes its binding to heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (HNRNPs), with consequent release of the HEXIM1/P-TEFb complex – leading to the induction of growth factor-stimulated transcriptional responses. The methylation of 7SK relies on the activation of METTL3 via phosphorylation downstream of growth factors-signaling pathways such as the epidermal growth factor (EGF). Our findings establish a novel function for the m 6 A modification in converting growth-factor signaling events to a transcriptional elongation regulatory response via an RNA-methylation-dependent switch. One-Sentence Summary m 6 A methylation of the non-coding RNA 7SK promotes transcriptional activity upon growth factor stimulation.