Abstract To accelerate the cardiac drug discovery pipeline, we set out to develop a platform that would be capable of quantifying tissue-level functions such as contractile force and be amenable to standard multiwell-plate manipulations. We report a 96-well-based array of 3D human pluripotent stem cell (hPSC)-derived cardiac microtissues - termed Cardiac MicroRings (CaMiRi) - in custom 3D-print-molded multiwell plates capable of contractile force measurement. Within each well, two elastomeric microcantilevers are situated above a circumferential ramp. The wells are seeded with cell-laden collagen, which, in response to the gradual slope of the circumferential ramp, self-organizes around tip-gated microcantilevers to form contracting CaMiRi. The contractile force exerted by the CaMiRi is measured and calculated using the deflection of the cantilevers. Platform responses were robust and comparable across wells, and we used it to determine an optimal tissue formulation. We validated the contractile force response of CaMiRi using selected cardiotropic compounds with known effects. Additionally, we developed automated protocols for CaMiRi seeding, image acquisition, and analysis to enable the measurement of contractile force with increased throughput. The unique tissue fabrication properties of the platform, and the consequent effects on tissue function, were demonstrated upon adding hPSC-derived epicardial cells to the system. This platform represents an open-source contractile force screening system useful for drug screening and tissue engineering applications.

ABSTRACT To accelerate the cardiac drug discovery pipeline, we set out to develop a platform that would be amenable to standard multiwell-plate manipulations and be capable of quantifying tissue-level functions such as contractile force. We report a 96-well-based array of 3D human pluripotent stem cell (hPSC)-derived cardiac microtissues - termed Cardiac MicroRings (CaMiRi) - in custom printed multiwell plates capable of contractile force measurement. Within each well, two elastomeric microcantilevers are situated above a ramp. The wells are seeded with cell-laden collagen which, in response to the slope of the ramp, self-organizes around tip-gated microcantilevers to form contracting CaMiRi. The contractile force exerted by the CaMiRi is measured and calculated using the deflection of the cantilevers. Platform responses were robust and comparable across wells and we used it to determine an optimal tissue formulation. We validated contractile force response of CaMiRi using selected cardiotropic compounds with known effects. Additionally, we developed automated protocols for CaMiRi seeding, image acquisition, and analysis to enable measurement of contractile force with increased throughput. The unique tissue fabrication properties of the platform, and the consequent effects on tissue function, were demonstrated upon adding hPSC-derived epicardial cells to the system. This platform represents an open-source contractile force screening system useful for drug screening and tissue engineering applications.

ABSTRACT The emergence of germ layers in embryos during gastrulation is a key developmental milestone. How morphogenetic signals engage the regulatory networks responsible for early embryonic tissue patterning is incompletely understood. To understand this, we developed a gene regulatory network (GRN) model of human pluripotent stem cell (hPSC) lineage commitment and embedded it into ‘cellular’ agents that respond to a dynamic signalling microenvironment. We found that cellular pattern order, composition, and dynamics were predictably manipulable based on the GRN wiring. We showed that feedback between OCT4, and BMP and WNT pathways created a dynamic OCT4 front that mediates the spatiotemporal evolution of developmental patterns. Translocation of this radial front can be predictively disrupted in vitro to control germ-layer pattern composition. This work links the emergence of multicellular patterns to regulatory network activity in individual hPSCs. We anticipate our approach will help to understand how GRN structure regulates organogenesis in different contexts.

Summary Low differentiation propensity towards a targeted lineage can significantly hamper the utility of individual human pluripotent stem cell (hPSC) lines in biomedical applications. Here, we use monolayer and micropatterned cell cultures, as well as transcriptomic profiling, to investigate how variability in signalling pathway activity between human embryonic stem cell lines affects their differentiation efficiency towards definitive endoderm (DE). We show that endogenous suppression of WNT signalling in hPSCs at the onset of differentiation prevents the switch from self-renewal to DE specification. Gene expression profiling reveals that this inefficient switch is reflected in NANOG expression dynamics. Importantly, we demonstrate that higher WNT stimulation or inhibition of the PI3K/AKT signalling can overcome the DE commitment blockage. Our findings highlight that redirection of the activity of Activin/NODAL pathway by WNT signalling towards mediating DE fate specification is a vulnerable spot, as disruption of this process can result in poor hPSC specification towards DE.

In vitro models of post-implantation human development are valuable to the fields of regenerative medicine, and developmental biology. Here, we report characterization of a robust in vitro platform that enabled high-throughput screening of multiple human pluripotent stem cell (hPSC) lines for their ability to undergo peri-gastrulation-like fate patterning upon BMP4 treatment of geometrically-confined colonies and observed significant variability. Further, we observed that when hPSCs were permitted to differentiate in conditions unsupportive of pluripotency, upregulation of endogenous Nodal correlated with expression of a gastrulation-associated gene profile, whereas Nodal downregulation correlated with a neurulation-associated gene profile expression. Given these observations, we hypothesized that inhibiting Nodal during a peri-gastrulation-like induction would induce fate patterning associated with the early stages of neurulation and observed experimental results consistent with this hypothesis. Mechanistically, we demonstrate a reaction-diffusion mediated self-organization of phosphorylated-SMAD1 signaling, and a positional-information mediated patterning of pre-neurulation-associated fates. Our work identifies a Nodal signaling dependent switch in peri-gastrulation versus pre-neurulation-associated fate patterning in hPSC colonies and hints towards possible conserved mechanisms of self-organized fate specification in differentiating epiblast and ectodermal tissues.

Pluripotent stem cells (PSCs) exist in multiple stable states, each with specific cellular properties and molecular signatures. The process by which pluripotency is either maintained or destabilized to initiate specific developmental programs is poorly understood. We have developed a model to predict stabilized PSC gene regulatory network (GRN) states in response to combinations of input signals. While previous attempts to model PSC fate have been limited to static cell compositions, our approach enables simulations of dynamic heterogeneity by combining an Asynchronous Boolean Simulation (ABS) strategy with simulated single cell fate transitions using Strongly Connected Components (SCCs). This computational framework was applied to a reverse-engineered and curated core GRN for mouse embryonic stem cells (mESCs) to simulate responses to LIF, Wnt/β-catenin, FGF/ERK, BMP4, and Activin A/Nodal pathway activation. For these input signals, our simulations exhibit strong predictive power for gene expression patterns, cell population composition, and nodes controlling cell fate transitions. The model predictions extend into early PSC differentiation, demonstrating, for example, that a Cdx2-high/Oct4-low state can be efficiently and robustly generated from mESCs residing in a naïve and signal-receptive state sustained by combinations of signaling activators and inhibitors.

A growing body of evidence highlights the importance of the cellular microenvironment as a regulator of phenotypic and functional cellular responses to perturbations. We have previously developed cell patterning techniques to control population context parameters, and here we demonstrate context-explorer(CE), a software tool to improve investigation of microenvironmental variables through colony level analyses. We demonstrate the capabilities of CE in the analysis of human and mouse pluripotent stem cells (hPSCs, mPSCs) patterned in colonies of defined size and shape in multi-well plates. CE employs a density-based clustering algorithm to identify cell colonies within micropatterned wells. Using this automatic colony classification methodology, we obtain accuracies comparable to manual colony counts in a fraction of the time.Classifying cells according to their relative position within a colony enables statistical analysis of radial spatial trends in protein expression within multiple colonies in the same treatment group. When applied to colonies of hPSCs, our analysis reveals a radial gradient in the expression of the pluripotency inducing transcription factors SOX2 and OCT4, and a similar trend in the intra-colony location of different cellular phenotypes. We extend these analyses to colonies of different sizes and shapes and demonstrate how the metrics derived by CE can be used to asses the patterning fidelity of micropatterned plates.We have incorporated a number of features to enhance the usability and utility of CE. To appeal to a broad scientific community, all of the software's functionality is accessible from a graphical user interface, and convenience functions for several common data operations are included. CE is compatible with existing image analysis programs and extends the analytical capabilities already provided by these tools. Taken together, CE facilitates investigation of spatially heterogeneous cell populations in fundamental research and drug development validation programs.

Abstract The emergence of the anterior-posterior body axis during early gastrulation constitutes a symmetry-breaking event, which is key to the development of bilateral organisms, and its mechanism remains poorly understood. Two-dimensional gastruloids constitute a simple and robust framework to study early developmental events in vitro. Although spontaneous symmetry breaking has been observed in three dimensional (3D) gastruloids, the mechanisms behind this phenomenon are poorly understood. We thus set out to explore whether a controllable 2D system could be used to reveal the mechanisms behind the emergence of asymmetry in patterned cellular structures. We first computationally simulated the emergence of organization in micro-patterned mouse pluripotent stem cell (mPSC) colonies using a Turing-like activator-repressor model with activator-concentration-dependent flux boundary condition at the colony edge. This approach allows the self-organization of the boundary conditions, which results in a larger variety of patterns than previously observed. We found that this model recapitulated previous results of centro-symmetric patterns in large colonies, and also that in simulated small colony sizes, patterns with spontaneous asymmetries emerged. Model analysis revealed reciprocal effects between diffusion and size of the colony, with model-predicted asymmetries in small pattern sizes being dominated by diffusion, and centro-symmetric patterns being size-dominated. To test these predictions, we performed experiments on micro-patterned mPSC colonies of different sizes stimulated with Bone Morphogenetic Protein 4 (BMP4), and used Brachyury (BRA)-GFP expressing cells as pattern readout. We found that while large colonies showed centro-symmetric BRA patterns, the probability of colony polarization increased with decreasing sizes, with a maximum polarization frequency of 35% at ∼200μm. These results indicate that a simple molecular activator-repressor system can provide cells with collective features capable of initiating a body-axes plan, and constitute a theoretical foundation for the engineering of asymmetry in developmental systems.