Recent studies have identified a subpopulation of highly tumorigenic cells with stem/progenitor cell properties from human breast cancers, and it has been suggested that stem/progenitor cells, which remain after breast cancer therapy, may give rise to recurrent disease. We hypothesized that progenitor cells are resistant to radiation, a component of conventional breast cancer therapy, and that that resistance is mediated at least in part by Wnt signaling, which has been implicated in stem cell survival. To test this hypothesis, we investigated radioresistance by treating primary BALB/c mouse mammary epithelial cells with clinically relevant doses of radiation and found enrichment in normal progenitor cells (stem cell antigen 1-positive and side population progenitors). Radiation selectively enriched for progenitors in mammary epithelial cells isolated from transgenic mice with activated Wnt/β-catenin signaling but not for background-matched controls, and irradiated stem cell antigen 1-positive cells had a selective increase in active β-catenin and survivin expression compared with stem cell antigen 1-negative cells. In clonogenic assays, colony formation in the stem cell antigen 1-positive progenitors was unaffected by clinically relevant doses of radiation. Radiation also induced enrichment of side population progenitors in the human breast cancer cell line MCF-7. These data demonstrate that, compared with differentiated cells, progenitor cells have different cell survival properties that may facilitate the development of targeted antiprogenitor cell therapies.

BackgroundInflammatory breast cancer (IBC) represents the most aggressive presentation of breast cancer. Women diagnosed with IBC typically have a poorer prognosis compared with those diagnosed with non-IBC tumors. Recommendations and guidelines published to date on the diagnosis, management, and follow-up of women with breast cancer have focused primarily on non-IBC tumors. Establishing a minimum standard for clinical diagnosis and treatment of IBC is needed.MethodsRecognizing IBC to be a distinct entity, a group of international experts met in December 2008 at the First International Conference on Inflammatory Breast Cancer to develop guidelines for the management of IBC.ResultsThe panel of leading IBC experts formed a consensus on the minimum requirements to accurately diagnose IBC, supported by pathological confirmation. In addition, the panel emphasized a multimodality approach of systemic chemotherapy, surgery, and radiation therapy.ConclusionsThe goal of these guidelines, based on an expert consensus after careful review of published data, is to help the clinical diagnosis of this rare disease and to standardize management of IBC among treating physicians in both the academic and community settings.

Epithelial–mesenchymal transition (EMT) is associated with characteristics of breast cancer stem cells, including chemoresistance and radioresistance. However, it is unclear whether EMT itself or specific EMT regulators play causal roles in these properties. Here we identify an EMT-inducing transcription factor, zinc finger E-box binding homeobox 1 (ZEB1), as a regulator of radiosensitivity and DNA damage response. Radioresistant subpopulations of breast cancer cells derived from ionizing radiation exhibit hyperactivation of the kinase ATM and upregulation of ZEB1, and the latter promotes tumour cell radioresistance in vitro and in vivo. Mechanistically, ATM phosphorylates and stabilizes ZEB1 in response to DNA damage, ZEB1 in turn directly interacts with USP7 and enhances its ability to deubiquitylate and stabilize CHK1, thereby promoting homologous recombination-dependent DNA repair and resistance to radiation. These findings identify ZEB1 as an ATM substrate linking ATM to CHK1 and the mechanism underlying the association between EMT and radioresistance. Ma and colleagues show that when the EMT-associated transcription factor ZEB1 is stabilized by the ATM kinase, it interacts with the ubiquitin protease USP7 to counteract CHK1 degradation and promote DNA repair in breast cancer cells.

It has been proposed that an aggressive secondary cancer stem cell population arises from a primary cancer stem cell population through acquisition of additional genetic mutations and drives cancer progression. Overexpression of Polycomb protein EZH2, essential in stem cell self-renewal, has been linked to breast cancer progression. However, critical mechanism linking increased EZH2 expression to BTIC (breast tumor initiating cell) regulation and cancer progression remains unclear. Here, we identify a mechanism in which EZH2 expression-mediated downregulation of DNA damage repair leads to accumulation of recurrent RAF1 gene amplification in BTICs, which activates p-ERK-β-catenin signaling to promote BTIC expansion. We further reveal that AZD6244, a clinical trial drug that inhibits RAF1-ERK signaling, could prevent breast cancer progression by eliminating BTICs.

Purpose To quantify the multi-institutional and multiobserver variability of target and organ-at-risk (OAR) delineation for breast-cancer radiotherapy (RT) and its dosimetric impact as the first step of a Radiation Therapy Oncology Group effort to establish a breast cancer atlas. Methods and Materials Nine radiation oncologists specializing in breast RT from eight institutions independently delineated targets (e.g., lumpectomy cavity, boost planning target volume, breast, supraclavicular, axillary and internal mammary nodes, chest wall) and OARs (e.g., heart, lung) on the same CT images of three representative breast cancer patients. Interobserver differences in structure delineation were quantified regarding volume, distance between centers of mass, percent overlap, and average surface distance. Mean, median, and standard deviation for these quantities were calculated for all possible combinations. To assess the impact of these variations on treatment planning, representative dosimetric plans based on observer-specific contours were generated. Results Variability in contouring the targets and OARs between the institutions and observers was substantial. Structure overlaps were as low as 10%, and volume variations had standard deviations up to 60%. The large variability was related both to differences in opinion regarding target and OAR boundaries and approach to incorporation of setup uncertainty and dosimetric limitations in target delineation. These interobserver differences result in substantial variations in dosimetric planning for breast RT. Conclusions Differences in target and OAR delineation for breast irradiation between institutions/observers appear to be clinically and dosimetrically significant. A systematic consensus is highly desirable, particularly in the era of intensity-modulated and image-guided RT. To quantify the multi-institutional and multiobserver variability of target and organ-at-risk (OAR) delineation for breast-cancer radiotherapy (RT) and its dosimetric impact as the first step of a Radiation Therapy Oncology Group effort to establish a breast cancer atlas. Nine radiation oncologists specializing in breast RT from eight institutions independently delineated targets (e.g., lumpectomy cavity, boost planning target volume, breast, supraclavicular, axillary and internal mammary nodes, chest wall) and OARs (e.g., heart, lung) on the same CT images of three representative breast cancer patients. Interobserver differences in structure delineation were quantified regarding volume, distance between centers of mass, percent overlap, and average surface distance. Mean, median, and standard deviation for these quantities were calculated for all possible combinations. To assess the impact of these variations on treatment planning, representative dosimetric plans based on observer-specific contours were generated. Variability in contouring the targets and OARs between the institutions and observers was substantial. Structure overlaps were as low as 10%, and volume variations had standard deviations up to 60%. The large variability was related both to differences in opinion regarding target and OAR boundaries and approach to incorporation of setup uncertainty and dosimetric limitations in target delineation. These interobserver differences result in substantial variations in dosimetric planning for breast RT. Differences in target and OAR delineation for breast irradiation between institutions/observers appear to be clinically and dosimetrically significant. A systematic consensus is highly desirable, particularly in the era of intensity-modulated and image-guided RT.

Abstract Mesenchymal stem cells (MSC) migrate to and proliferate within sites of inflammation and tumors as part of the tissue remodeling process. Radiation increases the expression of inflammatory mediators that could enhance the recruitment of MSC into the tumor microenvironment. To investigate this, bilateral murine 4T1 breast carcinomas (expressing renilla luciferase) were irradiated unilaterally (1 or 2 Gy). Twenty-four hours later, 2 × 105 MSC-expressing firefly luciferase were injected i.v. Mice were then monitored with bioluminescent imaging for expression of both renilla (tumor) and firefly (MSC) luciferase. Forty-eight hours postirradiation, levels of MSC engraftment were 34% higher in tumors receiving 2 Gy (P = 0.004) than in the contralateral unirradiated limb. Immunohistochemical staining of tumor sections from mice treated unilaterally with 2 Gy revealed higher levels of MSC in the parenchyma of radiated tumors, whereas a higher proportion of MSC remained vasculature-associated in unirradiated tumors. To discern the potential mediators involved in MSC attraction, in vitro migration assays showed a 50% to 80% increase in MSC migration towards conditioned media from 1 to 5 Gy–irradiated 4T1 cells compared with unirradiated 4T1 cells. Irradiated 4T1 cells had increased expression of the cytokines, transforming growth factor-β1, vascular endothelial growth factor, and platelet-derived growth factor-BB, and this up-regulation was confirmed by immunohistochemistry in tumors irradiated in vivo. Interestingly, the chemokine receptor CCR2 was found to be up-regulated in MSC exposed to irradiated tumor cells and inhibition of CCR2 led to a marked decrease of MSC migration in vitro. In conclusion, clinically relevant low doses of irradiation increase the tropism for and engraftment of MSC in the tumor microenvironment. [Cancer Res 2007;67(24):11687–95]

BackgroundWe evaluated discordance in expression measurements for estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and HER2 between primary and recurrent tumors in patients with recurrent breast cancer and its effect on prognosis.MethodsA total of 789 patients with recurrent breast cancer were studied. ER, PR, and HER2 status were determined by immunohistochemistry (IHC) and/or FISH. Repeat markers for ER, PR, and HER2 were available in 28.9%, 27.6%, and 70.0%, respectively. Primary and recurrent tumors were classified as triple receptor-negative breast cancer (TNBC) or receptor-positive breast cancer (RPBC, i.e. expressing at least one receptor). Discordance was correlated with clinical/pathological parameters.ResultsDiscordance for ER, PR, and HER2 was 18.4%, 40.3%, and 13.6%, respectively. Patients with concordant RPBC had significantly better post-recurrence survival (PRS) than discordant cases; patients with discordant receptor status had similarly unfavorable survival as patients with concordant TNBC. IHC scores for ER and PR showed weak concordance between primary and recurrent tumors. Concordance of HER2–FISH scores was higher.ConclusionsConcordance of quantitative hormone receptor measurements between primary and recurrent tumors is modest consistent with suboptimal reproducibility of measurement methods, particularly for IHC. Discordant cases have poor survival probably due to inappropriate use of targeted therapies. However, biological change in clinical phenotype cannot be completely excluded.

The most appropriate dose fractionation for whole-breast irradiation (WBI) remains uncertain.OBJECTIVE To assess acute and 6-month toxic effects and quality of life (QOL) with conventionally fractionated WBI (CF-WBI) vs hypofractionated WBI (HF-WBI).DESIGN, SETTING, AND PARTICIPANTS Unblinded randomized trial of CF-WBI (n = 149; 50.00 Gy/25 fractions + boost [10.00-14.00Gy/5-7 fractions]) vs HF-WBI (n = 138; 42.56 Gy/16 fractions + boost [10.00-12.50Gy/4-5 fractions]) following breast-conserving surgery administered in community-based and academic cancer centers to 287 women 40 years or older with stage 0 to II breast cancer for whom WBI without addition of a third field was recommended; 76% of study participants (n = 217) were overweight or obese.Patients were enrolled from February 2011 through February 2014 and observed for a minimum of 6 months. INTERVENTIONS Administration of CF-WBI or HF-WBI.MAIN OUTCOMES AND MEASURES Physician-reported acute and 6-month toxic effects using National Cancer Institute Common Toxicity Criteria, and patient-reported QOL using the Functional Assessment of Cancer Therapy for Patients with Breast Cancer (FACT-B).All analyses were intention to treat, with outcomes compared using the χ 2 test, Cochran-Armitage test, and ordinal logistic regression. RESULTSOf 287 participants, 149 were randomized to CF-WBI and 138 to HF-WBI.Treatment arms were well matched for baseline characteristics, including FACT-B total score (HF-WBI, 120.1 vs CF-WBI, 118.8;P = .46)and individual QOL items such as somewhat or more lack of energy (HF-WBI, 38% vs CF-WBI, 39%; P = .86)and somewhat or more trouble meeting family needs (HF-WBI, 10% vs CF-WBI, 14%; P = .54).Maximum physician-reported acute dermatitis (36% vs 69%; P < .001),pruritus (54% vs 81%; P < .001),breast pain (55% vs 74%; P = .001),hyperpigmentation (9% vs 20%; P = .002),and fatigue (9% vs 17%; P = .02)during irradiation were lower in patients randomized to HF-WBI.The rate of overall grade 2 or higher acute toxic effects was less with HF-WBI than with CF-WBI (47% vs 78%; P < .001).Six months after irradiation, physicians reported less fatigue in patients randomized to HF-WBI (0% vs 6%; P = .01),and patients randomized to HF-WBI reported less lack of energy (23% vs 39%; P < .001)and less trouble meeting family needs (3% vs 9%; P = .01).Multivariable regression confirmed the superiority of HF-WBI in terms of patient-reported lack of energy (odds ratio [OR], 0.39; 95% CI, 0.24-0.63)and trouble meeting family needs (OR, 0.34; 95% CI, 0.16-0.75). CONCLUSIONS AND RELEVANCETreatment with HF-WBI appears to yield lower rates of acute toxic effects than CF-WBI as well as less fatigue and less trouble meeting family needs 6 months after completing radiation therapy.These findings should be communicated to patients as part of shared decision making.

ABSTRACT NDRG1 is widely described as a metastasis suppressor in breast cancer. However, we found that NDRG1 is critical in promoting tumorigenesis and brain metastasis in mouse models of inflammatory breast cancer (IBC), a rare but highly aggressive form of breast cancer. We hypothesized that NDRG1 is a prognostic marker associated with poor outcome in patients with IBC. Microarray gene expression data from the IBC Consortium dataset were analyzed to compare NDRG1 expression between IBC and non-IBC tumors and among breast cancer subtypes. NDRG1 levels in tissue microarrays from 64 IBC patients were evaluated by immunohistochemical staining with anti-NDRG1 primary antibody (32 NDRG1-low [≤ median], 32 NDRG1-high [>median]). Overall and disease-free survival (OS and DSS) were analyzed with Kaplan–Meier curves and log-rank test. NDRG1 mRNA expression was higher in IBC than in non-IBC tumors ( p =0.007), and in more aggressive HER2+ and basal-like vs luminal IBC subtypes ( p <0.0001). Univariate analysis showed NDRG1 expression, tumor grade, disease stage, estrogen receptor (ER) status, and receipt of adjuvant radiation to be associated with OS and DSS. NDRG1-high patients had poorer 10-year OS and DSS than NDRG1-low patients (OS, 19% vs 45%, p =0.0278; DSS, 22% vs 52%, p =0.0139). On multivariable analysis, NDRG1 independently predicted OS (hazard ratio [HR]=2.034, p =0.0274) and DSS (HR=2.287, p =0.0174). NDRG1-high ER-negative tumors had worse outcomes OS, p =0.0003; DSS, p =0.0003; and NDRG1-high tumors that received adjuvant radiation treatment had poor outcomes (OS, p =0.0088; DSS, p =0.0093). NDRG1 correlated positively with aggressive tumor characteristics in IBC and was a significant independent prognostic factor for DSS and OSS in IBC patients. Targeting NDRG1 may represent a novel strategy for improving clinical outcomes for patients with IBC.

Abstract Inflammatory breast cancer (IBC) is an aggressive form of primary breast cancer characterized by rapid onset and high risk of metastasis and poor clinical outcomes. The biological basis for the aggressiveness of IBC is still not well understood and no IBC-specific targeted therapies exist. In this study we report that lipocalin 2 (LCN2), a small secreted glycoprotein belonging to the lipocalin superfamily, is expressed at significantly higher levels in IBC versus non-IBC tumors, independently of molecular subtype. LCN2 levels were also significantly higher in IBC cell lines and in their culture media than in non-IBC cell lines. High expression was associated with poor-prognosis features and shorter overall survival in IBC patients. Depletion of LCN2 in IBC cell lines reduced proliferation, colony formation, migration, and cancer stem cell populations in vitro, and inhibited tumor growth, skin invasion, and brain metastasis in mouse models of IBC. Analysis of our proteomics data showed reduced expression of proteins involved in cell cycle and DNA repair in LCN2-silenced IBC cells. Our findings support that LCN2 promotes IBC tumor aggressiveness and offer a new potential therapeutic target for IBC.