Abstract Neutrophils are frequently studied in murine models, but the extent to which findings translate to humans remains poorly defined. Here, we performed an integrative transcriptomic analysis of 11 murine and 13 human datasets. In homeostasis, neutrophils exhibited the highest number of lineage-specific genes and the greatest degree of correlated expression among genes with one-to-one orthologs ( r = 0.79, P < 2.2 × 10 −16 ) compared to other leukocytes. In inflammation, neutrophils displayed considerable transcriptional diversity, but shared a core inflammation program across a broad range of conditions which was conserved between species. This core program included genes encoding IL-1 family members, CD14, IL-4R, CD69 and PD-L1. Chromatin accessibility of core inflammation genes increased significantly in blood compared to bone marrow and further with migration from blood to tissue. Transcription factor enrichment analysis nominated members of the NF-κB family and AP-1 complex as important drivers of the core inflammation program, and HoxB8 neutrophils with JUNB knockout showed a significantly reduced expression of core inflammation genes at baseline and upon stimulation. In vitro perturbations confirmed surface protein upregulation of core inflammation members in both species. Together, we demonstrate substantial transcriptional conservation in neutrophils in homeostasis and identify a core inflammation program conserved across species. This systems biology approach can be leveraged to improve transitions between the murine and human context. Key Points The transcriptome of resting neutrophils is substantially conserved between humans and mice A core inflammation program in neutrophils is shared across a broad range of conditions and conserved across humans and mice Graphical Abstract

ABSTRACT TRAF1/C5 was among the first loci shown to confer risk for inflammatory arthritis in the absence of an associated coding variant, but its genetic mechanism remains undefined. Using ImmunoChip data from 3,939 juvenile idiopathic arthritis (JIA) patients and 14,412 controls, we identified 132 plausible common non-coding variants, reduced serially by SNP-seq, electrophoretic mobility shift, and luciferase studies to the single variant rs7034653 in the third intron of TRAF1 . Genetically manipulated experimental cells and primary monocytes from genotyped donors establish that the risk G allele reduces binding of Fos-Related Antigen 2 (FRA2), resulting in reduced TRAF1 expression and enhanced TNF production. Conditioning on this variant eliminates attributable risk for rheumatoid arthritis, implicating a mechanism shared across the arthritis spectrum. These findings reveal that rs7034653, FRA2, and TRAF1 mediate a pathway through which a non-coding causal variant drives risk of inflammatory arthritis in children and adults.

ABSTRACT Fine-mapping and functional studies implicate rs117701653, a common non-coding variant in the CD28/CTLA4/ICOS locus, as a contributor to risk for rheumatoid arthritis and type 1 diabetes. Using DNA pulldown, mass spectrometry, genome editing and eQTL analysis, we establish that the disease-associated allele reduces affinity for the inhibitory chromosomal regulator SMCHD1 to drive expression of inducible T-cell costimulator (ICOS), enhancing memory CD4 + T cell ICOS expression in individuals bearing the risk allele. Higher ICOS expression is paralleled by an increase in circulating T peripheral helper (Tph) cells, and in rheumatoid arthritis patients, of blood and joint fluid Tph cells and circulating plasmablasts, suggesting a causal link. Indeed, ICOS ligation accelerates T cell differentiation into CXCR5 - PD-1 high Tph cells producing IL-21 and CXCL13, as does carriage of the rs117701653 risk allele. Thus, mechanistic dissection of a causal non-coding variant in human autoimmunity discloses a new pathway through which ICOS regulates Tph abundance.

ABSTRACT Objectives Neutrophils are typically the most abundant leukocyte in arthritic synovial fluid. We sought to understand changes that occur in neutrophils as they migrate from blood to joint. Methods We performed RNA sequencing of neutrophils from healthy human blood, arthritic blood, and arthritic synovial fluid, comparing transcriptional signatures with those from murine K/BxN serum transfer arthritis. We employed mass cytometry to quantify protein expression and sought to reproduce the synovial fluid phenotype ex vivo in cultured healthy blood neutrophils. Results Blood neutrophils from healthy donors and patients with active arthritis exhibited largely similar transcriptional signatures. By contrast, synovial fluid neutrophils exhibited more than 1,600 differentially expressed genes. Gene signatures identified a prominent response to interferon gamma (IFNγ), as well as to tumor necrosis factor, interleukin 6, and hypoxia, in both humans and mice. Mass cytometry also found healthy and arthritic donor blood neutrophils largely indistinguishable but revealed a range of neutrophil phenotypes in synovial fluid defined by downregulation of CXCR1 and upregulation of FcγRI, HLA-DR, PD-L1, ICAM-1 and CXCR4. Reproduction of key elements of this signature in cultured blood neutrophils required both IFNγ and prolonged culture. Conclusions Circulating neutrophils from arthritis patients resemble those from healthy controls, but joint fluid cells exhibit a network of changes, conserved across species, that implicate IFNγ response and aging as complementary drivers of the synovial neutrophil phenotype. KEY MESSAGES What is already known about this subject? Neutrophils are central in the effector phase of inflammatory arthritis but their phenotypic heterogeneity in inflamed synovial fluid is poorly understood. What does this study add? RNA-seq and mass cytometry identify a hallmark phenotype of neutrophils in synovial fluid consisting of upregulated ICAM-1, HLA-DR, PD-L1, Fc receptors and CXCR4. Transcriptomics highlight an IFNγ response signature conserved across humans and mice. In vitro experiments implicate aging and IFNγ as complementary factors orchestrating the synovial fluid neutrophil phenotype. How might this impact on clinical practice or future developments? Understanding the specific features of neutrophils in the arthritic joint may disclose opportunities for safe therapeutic targeting of this lineage.

Abstract Genome-wide association studies implicate multiple loci in risk for systemic lupus erythematosus (SLE), but few contain exonic variants, rendering systematic identification of non-coding variants essential to decoding SLE genetics. We utilized SNP-seq and bioinformatic enrichment to interrogate 2180 single-nucleotide polymorphisms (SNPs) from 87 SLE risk loci for potential binding of transcription factors and related proteins from B cells. 52 SNPs that passed initial screening were tested by electrophoretic mobility shift and luciferase reporter assays. To validate the approach, we studied rs2297550 in detail, finding that the risk allele enhanced binding to the transcription factor Ikaros (IKZF1), thereby modulating expression of IKBKE . Correspondingly, primary cells from genotyped healthy donors bearing the risk allele expressed higher levels of the interferon / NF-κB regulator IKKε. Together, these findings define a set of likely functional non-coding lupus risk variants and identify a new regulatory pathway involving rs2297550, Ikaros, and IKKε implicated by human genetics in risk for SLE.

Among 1.8 billion people worldwide infected with Mycobacterium tuberculosis, 5-15% are expected to develop active tuberculosis (TB). Approximately half of these will progress to active TB within the first 18 months after infection, presumably because they fail to mount the initial immune response that contains the local bacterial spread. The other half will reactivate their latent infection later in life, likely triggered by a loss of immune competence due to factors such as HIV-associated immunosuppression or ageing. This natural history suggests that undiscovered host genetic factors may control early progression to active TB. Here, we report results from a large genome-wide genetic study of early TB progression. We genotyped a total of 4,002 active TB cases and their household contacts in Peru and quantified genetic heritability (hg2) of early TB progression to be 21.2% under the liability scale. Compared to the reported hg2 of genome-wide TB susceptibility (15.5%), this result indicates early TB progression has a stronger genetic basis than population-wide TB susceptibility. We identified a novel association between early TB progression and variants located in an enhancer region on chromosome 3q23 (rs73226617, OR=1.19; P<5×10-8). We used in silico and in vitro analyses to identify likely functional variants and target genes, highlighting new candidate mechanisms of host response in early TB progression.

Abstract In emperipolesis, neutrophils transit through megakaryocytes, but it is unknown whether this interaction represents a single type of cell-in-cell interaction or a set of distinct processes. Using an in vitro model of murine emperipolesis, we characterized neutrophils entering megakaryocytes using live-cell spinning disk microscopy and electron microscopy. Approximately half of neutrophils exited the megakaryocyte rapidly, typically in 10 minutes or less, displaying ameboid morphology as they passed through the host cell (fast emperipolesis). The remaining neutrophils assumed a sessile morphology, most remaining within the megakaryocyte for at least 60 minutes (slow emperipolesis). These neutrophils typically localized near the megakaryocyte nucleus. By ultrastructural assessment, all internalized neutrophils remained morphologically intact. Most neutrophils resided within emperisomes, but some could be visualized exiting the emperisome into the cell cytoplasm. Neutrophils in the cytoplasm assumed close contact with the platelet-forming demarcation membrane system or with the perinuclear endoplasmic reticulum, as confirmed by immunofluorescence microscopy. Together, these findings reveal that megakaryocyte emperipolesis reflects at least two processes, fast and slow emperipolesis, each with its own characteristic transit time, morphology, and intracellular localization, suggesting distinct functions. Key Points Neutrophil passage through megakaryocytes, termed emperipolesis, diverges into fast and slow forms that differ in transit time, morphology, and intracellular localization During emperipolesis, neutrophils can reside in vacuoles (emperisomes) or escape into the cell cytoplasm to assume positions near the megakaryocyte’s demarcation membrane system, endoplasmic reticulum, or nucleus.