Abstract A thorough understanding of adaptation and speciation requires model organisms with both a history of ecological and phenotypic study as well as a robust set of genomic resources. For decades, the cactophilic Drosophila species of the southwestern US and northern Mexico have fit this profile, serving as a crucial model system for understanding ecological adaptation, particularly in xeric environments, as well as the evolution of reproductive incompatibilities and speciation. Here, we take a major step towards gaining a complete molecular description of this system by assembling and annotating seven chromosome-length de novo genomes across the three species D. mojavensis, D. arizonae , and D. navojoa . Using this data, we present the most accurate reconstruction of the phylogenetic history of this clade to date. We further demonstrate a relationship between structural evolution and coding evolution both within and between species in this clade, and use this relationship to generate novel hypotheses for adaptation genes. All of our data are presented in a new public database ( cactusflybase.arizona.edu ), providing one of the most in-depth resources for the analysis of inter- and intraspecific evolutionary genomic data.

Although RNA is found in the seminal fluid of diverse organisms, it is unknown whether it is functional within females. We developed a proteomic method (VESPA, Variant Enabled SILAC Proteomic Analysis) to test the hypothesis that Drosophila male seminal fluid RNA is translated by females. We found 67 male-derived, female-translated proteins (mdFTPs) in female lower reproductive tracts, many with predicted functions relevant to reproduction. Knockout experiments indicate that mdFTPs play diverse roles in postmating interactions, affecting fertilization success, and the formation/persistence of the insemination reaction mass, a trait hypothesized to be involved in sexual conflict. These findings advance our understanding of reproduction by revealing a mechanism of postmating molecular interactions between the sexes that strengthens and extends male influences on reproduction in previously unrecognized ways. Given the diverse species that carry RNA in seminal fluid, this discovery has broad significance for understanding molecular mechanisms of cooperation and conflict during reproduction.

Abstract Crops genetically engineered to produce insecticidal proteins from the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt) have advanced pest management, but their benefits are diminished when pests evolve resistance. Elucidating the genetic basis of pest resistance to Bt toxins can improve resistance monitoring, resistance management, and design of new insecticides. Here, we investigated the genetic basis of resistance to Bt toxin Cry1Ac in the lepidopteran Helicoverpa zea , one of the most damaging crop pests in the United States. To facilitate this research, we built the first chromosome-level genome assembly for this species, which has 31 chromosomes containing 375 Mb and 15,482 predicted proteins. Using a genome-wide association study, fine-scale mapping, and RNA-seq, we identified a 250-kb quantitative trait locus (QTL) on chromosome 13 that was strongly associated with resistance in a strain of H. zea that had been selected for resistance in the field and lab. The mutation in this QTL contributed to but was not sufficient for resistance, which implies alleles in more than one gene contributed to resistance. This QTL contains no genes with a previously reported role in resistance or susceptibility to Bt toxins. However, in resistant insects, this QTL has a premature stop codon in a kinesin gene which is a primary candidate as a mutation contributing to resistance. We found no changes in gene sequence or expression consistently associated with resistance for 11 genes previously implicated in lepidopteran resistance to Cry1Ac. Thus, the results reveal a novel and polygenic basis of resistance.

The emergence of third generation sequencing (3GS; long-reads) is making closer the goal of chromosome-size fragments in de novo genome assemblies. This allows the exploration of new and broader questions on genome evolution for a number of non-model organisms. However, long-read technologies result in higher sequencing error rates and therefore impose an elevated cost of sufficient coverage to achieve high enough quality. In this context, hybrid assemblies, combining short-reads and long-reads provide an alternative efficient and cost-effective approach to generate de novo , chromosome-level genome assemblies. The array of available software programs for hybrid genome assembly, sequence correction and manipulation is constantly being expanded and improved. This makes it difficult for non-experts to find efficient, fast and tractable computational solutions for genome assembly, especially in the case of non-model organisms lacking a reference genome or one from a closely related species. In this study, we review and test the most recent pipelines for hybrid assemblies, comparing the model organism Drosophila melanogaster to a non-model cactophilic Drosophila , D. mojavensis . We show that it is possible to achieve excellent contiguity on this non-model organism using the DBG2OLC pipeline.

Background Relationships between an organism and its environment can be fundamental in the understanding how populations change over time and species arise. Local ecological conditions can shape variation at multiple levels, among these are the evolutionary history and trajectories of coding genes. This study examines the rate of molecular evolution at protein-coding genes throughout the genome in response to host adaptation in the cactophilic Drosophila mojavensis. These insects are intimately associated with cactus necroses, developing as larvae and feeding as adults in these necrotic tissues. Drosophila mojavensis is composed of four isolated populations across the deserts of western North America and each population has adapted to utilize different cacti that are chemically, nutritionally, and structurally distinct.Results High coverage Illumina sequencing was performed on three previously unsequenced populations of D. mojavensis. Genomes were assembled using the previously sequenced genome of D. mojavensis from Santa Catalina Island (USA) as a template. Protein coding genes were aligned across all four populations and rates of protein evolution were determined for all loci using a several approaches.Conclusions Loci that exhibited elevated rates of molecular evolution tended to be shorter, have fewer exons, low expression, be transcriptionally responsive to cactus host use and have fixed expression differences across the four cactus host populations. Fast evolving genes were involved with metabolism, detoxification, chemosensory reception, reproduction and behavior. Results of this study gives insight into the process and the genomic consequences of local ecological adaptation.* 2L : Left arm of 2nd chromosome in D. melanogaster 2R : Right arm of 2nd chromosome in D. melanogaster 3L : Left arm of 3rd chromosome in D. melanogaster 3R : Right arm of 3rd chromosome in D. melanogaster ACP : Accessory gland protein ANOVA : Analysis of Variance BAM : Binary Alignment Map CDS : Coding sequence EMBOSS : European Molecular Biology Open Software Suite FDR : False Discovery Rate GO : Gene Ontology Gst : Glutathione S-transferase Ka : number of nonsynonymous substitution per nonsynonymous site kb : Kilobase KEGG : Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Ks : number of synonymous substitution per synonymous site MEGA : Molecular Evolutionary Genetics Analysis software PAML : Phylogenetic Analysis of Maximum Likelihood program PAML-FDR : PAML significant loci post-FDR correction PHYLIP : Phylogeny Inference Package RPKM : Reads Per Kilobase per Million mapped reads TOP10 : Loci with ω values in the top 10% of the distribution

A thorough understanding of adaptation and speciation requires model organisms with both a history of ecological and phenotypic study as well as a complete set of genomic resources. In particular, high-quality genome assemblies of ecological model organisms are needed to assess the evolution of genome structure and its role in adaptation and speciation. Here, we generate new genomes of cactophilic Drosophila, a crucial model clade for understanding speciation and ecological adaptation in xeric environments. We generated chromosome-level genome assemblies and complete annotations for seven populations across D. mojavensis, D. arizonae, and D. navojoa. We use this data first to establish the most robust phylogeny for this clade to date, and to assess patterns of molecular evolution across the phylogeny, showing concordance with a priori hypotheses regarding adaptive genes in this system. We then show that structural evolution occurs at constant rate across the phylogeny, varies by chromosome, and is correlated with molecular evolution. These results advance the understanding of the D. mojavensis clade by demonstrating core evolutionary genetic patterns and integrating those patterns to generate new gene-level hypotheses regarding adaptation. Our data are presented in a new public database (cactusflybase.arizona.edu), providing one of the most in-depth resources for the analysis of inter- and intraspecific evolutionary genomic data. Furthermore, we anticipate that the patterns of structural evolution identified here will serve as a baseline for future comparative studies to identify the factors that influence the evolution of genome structure across taxa.

Although RNA is found in the seminal fluid of diverse organisms, it is unknown whether this RNA is functional within females. Here, we develop an experimental proteomic method called VESPA (Variant Enabled SILAC Proteomic Analysis) to test the hypothesis that Drosophila male seminal fluid RNA is translated by females. We find strong evidence for 67 male-derived, female-translated proteins (mdFTPs) in female lower reproductive tracts at six hours postmating, many with predicted functions relevant to reproduction. Gene knockout experiments indicate that genes coding for mdFTPs play diverse roles in postmating interactions, with effects on fertilization efficiency, and the formation and persistence of the insemination reaction mass, a trait hypothesized to be involved in sexual conflict. These findings advance our understanding of reproduction by revealing a novel mechanism of postmating molecular interactions between the sexes that strengthens and extends male influences on reproductive outcomes in previously unrecognized ways. Given the diverse species known to carry RNA in seminal fluid, this discovery has broad significance for understanding molecular mechanisms of cooperation and conflict during reproduction.

Abstract Cactophilic species of the Drosophila buzzatii cluster ( repleta group) comprise an excellent model group to investigate genomic changes underlying adaptation to extreme climate conditions and host plants. In particular, these species offer a subject to study the transition from chemically simpler breeding sites (like prickly pears of the genus Opuntia ) to chemically more complex hosts (columnar cacti). Here, we report four highly contiguous genome assemblies of three species of the buzzatii cluster. Based on this genomic data and inferred phylogenetic relationships, we identified candidate taxonomically restricted genes (TRGs) likely involved in the evolution of cactophily and cactus host specialization in internal branches of the subgenus Drosophila . Functional enrichment analyses of TRGs within the buzzatii cluster identified genes involved in detoxification, water preservation, immune system response, anatomical structure development, and morphogenesis. In contrast, processes that regulate responses to stress, as well as the metabolism of nitrogen compounds, transport, and secretion were found in the set of species that are columnar cacti dwellers. These findings are in line with the hypothesis that those genomic innovations brought about instrumental mechanisms underlying adaptation in a group of species that speciated in the arid regions of South America.

The assembly of genomes from pooled samples of genetically heterogenous samples of conspecifics remains challenging. In this study we show that high-quality genome assemblies can be produced from samples of multiple wild-caught individuals. We sequenced DNA extracted from a pooled sample of conspecific herbivorous insects (Hemiptera: Miridae: Tupiocoris notatus) acquired from a greenhouse infestation in Tucson, Arizona (in the range of 30-100 individuals; 0.5 mL tissue by volume) using PacBio highly accurate long reads (HiFi). The initial assembly contained multiple haplotigs (>85% BUSCOs duplicated), but duplicate contigs could be easily purged to reveal a highly complete assembly (95.6% BUSCO, 4.4% duplicated) that is highly contiguous by short-read assembly standards (N50 = 675 kb; Largest contig = 4.3 Mb). We then used our assembly as the basis for a genome-guided differential expression study of host-plant specific transcriptional responses. We found thousands of genes (N = 4982) to be differentially expressed between our new data from individuals feeding on Datura wrightii (Solanaceae) and existing RNA-seq data from Nicotiana attenuata (Solanaceae) fed individuals. We identified many of these genes as previously documented detoxification genes such as glutathione-S-transferases, cytochrome P450s, UDP-glucosyltransferases. Together our results show that long-read sequencing of pooled samples can provide a cost-effective genome assembly option for small insects and provide insights into the genetic mechanisms underlying interactions between plants and herbivorous pests.