Abstract Epstein-Barr virus (EBV) infection is transmitted by saliva and is a major cause of cancer in people living with HIV/AIDS as well as in the general population. To better understand the determinants of oral EBV shedding we evaluated the frequency and quantity of detectable EBV in the saliva in a prospective cohort study of 85 adults in Uganda, half of whom were co-infected with HIV-1. Participants were not receiving antiviral medications, and those with HIV-1 co-infection had a CD4+ T cell count >200 cells/mm 3 . Daily, self-collected oral swabs were collected over a 4-week period. Compared with HIV-1 uninfected participants, co-infected participants had an increased frequency of oral EBV shedding (IRR=1.27, 95% CI=1.10-1.47). To explain why EBV oral shedding is greater in HIV-1 co-infected participants, we developed a stochastic, mechanistic mathematical model that describes the dynamics of EBV, infected cells, and antiviral cellular immune responses within the tonsillar epithelium, and examined parameter-specific differences between individuals of different HIV-1 infection statuses. We fit the model to our observational data using Approximate Bayesian Computation. After fitting, model simulations showed high fidelity to daily oral shedding time-courses and matched key summary statistics. Examination of the model revealed that higher EBV loads in saliva are driven by B cell activation causing EBV lytic replication in the tonsils, in combination with a less effective EBV-specific cellular immune response. Thus, both these factors contribute to higher and more frequent EBV shedding in HIV-1 co-infected individuals compared to HIV-1 uninfected individuals. These conclusions were further validated by modelling daily oral EBV shedding in a 26-participant North American cohort. Our results provide insights into the determinants of EBV shedding and implicate B cell activation to be a potential therapeutic target to reduce EBV replication in HIV-1 co-infected individuals at high risk for EBV-related malignancies. Author summary Epstein-Barr virus (EBV) is a ubiquitous infection worldwide. Infection with EBV is associated with the development of several kinds of cancer, including B cell lymphoma and nasopharyngeal carcinoma. Rates of EBV replication and disease are higher in individuals who are also infected with HIV-1. HIV-1 infection is associated with increased B cell activation, which is known to induce EBV reactivation, as well as immunodeficiency resulting from loss of T cells. However, whether these factors contribute to higher rates of EBV replication during co-infection, and by how much, was unknown. We analysed oral EBV shedding data in a cohort of adults from Uganda that were chronically infected with EBV. We found that participants that were HIV-1 infected were much more likely to have detectable quantities of EBV in their saliva. Also, when detected, the quantity of EBV present in the saliva was usually higher in HIV-1 infected participants. To better understand these findings, we developed a mathematical model to describe the dynamics of EBV, EBV-infected cells, and the cellular immune response within the tonsils. By rigorously matching our model to our participant data, we determined that high EBV loads in saliva are caused by high rates of infected B cell activation, as well as worse cellular immune control of EBV infection. These results provide an explanation of the impact of HIV-1 on EBV infection. Further, they suggest that strategies that suppress B cell activation may prevent EBV-related malignancy in people who are also infected with HIV-1.

ABSTRACT Herpes simplex virus (HSV) establishes latency in ganglionic neurons of the peripheral nervous system, from which it can reactivate, causing recurrent disease and possible transmission to a new host. Current anti-HSV therapy does not eliminate latent HSV, and thus is only suppressive rather than curative. We developed a potentially curative approach to latent HSV infection and pathogenesis, based on gene editing using HSV-specific meganucleases delivered by adeno-associated virus (AAV) vectors. Our results demonstrated that a dual meganuclease therapy, composed of two anti-HSV-1 meganucleases delivered by a triple AAV serotype combination (AAV9, AAV-Dj/8, AAV-Rh10), can eliminate up to 97% of latent HSV DNA from ganglia in both ocular and vaginal mouse models of latent HSV infection. Using a novel pharmacological approach to reactivate latent HSV-1 in mice with the bromodomain inhibitor JQ-1, we demonstrated that this reduction in ganglionic viral load leads to a significant reduction of viral shedding from treated vs . control mice, with many treated mice showing no detectable virus shedding. In general, therapy was well tolerated, although dose-ranging studies showed hepatotoxicity at high AAV doses, consistent with previous observations in animals and humans. Also in agreement with previous literature, we observed subtle histological evidence of neuronal injury in some experimental mice, although none of the mice demonstrated observable neurological signs or deficits. These results reinforce the curative potential of gene editing for latent orofacial and genital HSV disease, and provide a framework for additional safety studies before human trials can begin.

Quantitative PCR is the diagnostic pillar for clinical virology testing, and reference materials are necessary for accurate, comparable quantitation between clinical laboratories. Accurate quantitation of HHV-6 is important for detection of viral reactivation and inherited chromosomally integrated HHV-6 in immunocompromised patients. Reference materials in clinical virology commonly consist of laboratory-adapted viral strains that may be affected by the culture process. We performed next-generation sequencing to make relative copy number measurements at single nucleotide resolution of eight candidate HHV-6A and seven HHV-6B reference strains and DNA materials from the HHV-6 Foundation and Advanced Biotechnologies. 11 of 17 (65%) HHV6 candidate reference materials showed multiple copies of the origin of replication upstream of the U41 gene by next-generation sequencing. These large tandem repeats arose independently in culture-adapted HHV-6A and HHV-6B strains, measuring 1254 bp and 983 bp, respectively. Copy number measured between 4-10X copies relative to the rest of the genome. We also report the first interspecies recombinant HHV-6 strain with a HHV-6A GS backbone and >5.5kb region from HHV-6B Z29 from U41-U43 that covered the origin tandem repeat. Specific HHV-6A reference strains demonstrated duplication of regions at UL1/UL2, U87, and U89, as well as deletion in the U12-U24 region and U94/95 genes. HHV-6 strains derived from cord blood mononuclear cells from different labs on different continents revealed no copy number differences throughout the viral genome. These data indicate large origin tandem duplications are an adaptation of both HHV-6A and HHV-6B in culture and show interspecies recombination is possible within the Betaherpesvirinae.

Background: Norovirus outbreaks in hospital settings are a common challenge for infection prevention teams. Given the high burden of norovirus in most communities, it can be difficult to distinguish between on-going in-hospital transmission of virus and new introductions from the community and challenging to understand the long-term impacts of outbreak-associated viruses within medical systems using traditional epidemiological approaches alone. Methods: Real-time metagenomic sequencing during an on-going norovirus outbreak associated with a retrospective cohort study. Results: We describe a hospital-associated norovirus outbreak that affected 13 patients over a 27-day period in a large tertiary pediatric hospital and was chronologically associated with a spike in self-reported gastrointestinal symptoms among staff. Real-time metagenomic next-generation sequencing (mNGS) of norovirus genomes demonstrated that 10 chronologically overlapping hospital-acquired norovirus cases were partitioned into three discrete transmission clusters. Sequencing data also revealed close genetic relationships between some hospital-acquired and some community-acquired cases. Finally, this data was used to demonstrate chronic viral shedding by an immunocompromised hospital-acquired case patient. Analysis of serial samples from this patient provided novel insights into the evolution of norovirus within an immunocompromised host. Conclusions: This study documents one of the first applications of real-time mNGS during a hospital-associated viral outbreak. Given its demonstrated ability to detect transmission patterns within outbreaks and elucidate the long-term impacts of outbreak-associated viral strains on patients and medical systems, mNGS constitutes a powerful resource to help infection control teams understand, prevent, and respond to viral outbreaks.

Human herpesvirus 6B (HHV-6B) DNA is frequently detected in human samples, especially after hematopoietic cell transplantation (HCT). Diagnostic assays distinguishing HHV-6B reactivation from latency are limited, and this has contributed to confusion in research and made the design of clinical approaches to diagnose and treat HHV-6-associated diseases challenging. We used RNA sequencing to characterize and compare the HHV-6B transcriptome in multiple in vivo and in vitro sample types, including 1) whole blood from HCT recipients with and without HHV-6B plasma viremia; 2) tumor tissue samples from subjects with large B cell lymphoma infected with HHV-6B; 3) lymphoblastoid cell lines from subjects with inherited chromosomally integrated HHV-6B or latent infection with HHV-6B; and 4) HHV-6B Z29 infected SupT1 CD4+ T cells. We demonstrated substantial overlap in the HHV-6B transcriptome observed in in vivo and in vitro samples, although there was variability in the breadth and quantity of gene expression across samples. No HHV-6B transcripts were detected in whole blood samples from subjects without plasma HHV-6B viremia. The HHV-6B viral polymerase gene U38 was the only HHV-6B transcript detected in all RNA-seq data sets and was one of the most highly expressed genes. Using a novel reverse transcription quantitative PCR assay targeting HHV-6B U38, we identified U38 messenger RNA in all tested whole blood samples from patients with concurrent HHV-6B viremia, indicating its utility as a diagnostic assay for HHV-6B replication. This study demonstrates the feasibility of pathogen transcriptome analyses in HCT recipients to improve targets for diagnostic, and potentially therapeutic, applications.

Herpes simplex viruses (HSV) are difficult to sequence due to their large DNA genome, high GC content, and the presence of repeats. To date, most HSV genomes have been recovered from culture isolates, raising concern that these genomes may not accurately represent circulating clinical strains. We report the development and validation of a DNA oligonucleotide hybridization panel to recover near complete HSV genomes at abundances up to 50,000-fold lower than previously reported. Using copy number information on herpesvirus and host DNA background via quantitative PCR, we developed a protocol for pooling for cost-effective recovery of more than 50 HSV-1 or HSV-2 genomes per MiSeq run. We demonstrate the ability to recover >99% of the HSV genome at >100X coverage in 72 hours at viral loads that allow whole genome recovery from latently-infected ganglia. We also report a new computational pipeline for rapid HSV genome assembly and annotation. Using the above tools and a series of 17 HSV-1-positive clinical swabs sent to our laboratory for viral isolation, we show limited evolution of HSV-1 during viral isolation in human fibroblast cells compared to the original clinical samples. Our data indicate that previous studies using low passage clinical isolates of herpes simplex viruses are reflective of the viral sequences present in the lesion and thus can be used in phylogenetic analyses. We also detect superinfection within a single sample with unrelated HSV-1 strains recovered from separate oral lesions in an immunosuppressed patient during a 2.5-week period, illustrating the power of direct-from-specimen sequencing of HSV.