Abstract Endothelial cell (EC) sensing of fluid shear stress regulates atherosclerosis, a disease of arteries that causes heart attack and stroke. Atherosclerosis preferentially develops at regions of arteries exposed to low oscillatory shear stress (LOSS), whereas high shear regions are protected. We show using inducible EC-specific genetic deletion in hyperlipidaemic mice that the Notch ligands JAG1 and DLL4 have opposing roles in atherosclerosis. While endothelial Jag1 promoted atherosclerosis at sites of LOSS, endothelial Dll4 was atheroprotective. Analysis of porcine and murine arteries and cultured human coronary artery EC exposed to experimental flow revealed that JAG1 and its receptor NOTCH4 are strongly upregulated by LOSS. Functional studies in cultured cells and in mice with EC-specific deletion of Jag1 show that JAG1-NOTCH4 signalling drives vascular dysfunction by repressing endothelial repair. These data demonstrate a fundamental role for JAG1-NOTCH4 in sensing LOSS during disease, and suggest therapeutic targeting of this pathway to treat atherosclerosis.

The ability of endothelial cells (EC) to sense blood flow direction is a critical determinant of vascular health and disease. Unidirectional flow induces EC alignment and vascular homeostasis, whereas bidirectional flow has pathophysiological effects. EC express several mechanoreceptors that can respond to fluid flow (shear stress) but the mechanism for sensing the direction of shearing force is poorly understood. We observed using in vitro flow systems and magnetic tweezers that β1 integrin is a key sensor of force direction because it is activated by unidirectional but not bidirectional shearing forces. Consistently, β1 integrin was essential for Ca2+ signalling and cell alignment in response to unidirectional but not bidirectional shear stress. β1 integrin activation by unidirectional force was amplified in EC that were pre-sheared in the same direction, indicating that alignment and β1 integrin activity has a feedforward interaction which is a hallmark of system stability. En face staining and EC-specific genetic deletion studies of the murine aorta revealed that β1 integrin is activated and is essential for EC alignment at sites of unidirectional flow but is not activated at sites of bidirectional flow. In summary, β1 integrin sensing of unidirectional force is a key mechanism for decoding blood flow mechanics to promote vascular homeostasis.

Neutrophils have been implicated in the pathogenesis of atherosclerosis, a lipid-driven disease of arteries, but they are seldom found in atherosclerotic plaques. To resolve this longstanding paradox, we investigated whether neutrophil-derived microvesicles may influence arterial pathophysiology. Clinical and pre-clinical studies revealed that levels of circulating neutrophil microvesicles were enhanced by exposure to a high fat diet, a known risk factor for atherosclerosis. Neutrophil microvesicles accumulated at disease-prone regions of arteries that are exposed to complex flow patterns, and they promoted vascular inflammation and atherosclerosis in a murine model. Using cultured endothelial cells exposed to disturbed flow, it was demonstrated that neutrophil microvesicles promoted inflammatory gene expression by delivering a microRNA (miR-155) that enhanced NF-κB activation. Similary, neutrophil microvesicles increased miR-155 and enhanced NF-κB at disease-prone sites of disturbed flow in arteries of mice. We conclude that delivery of microvesicles carrying miR-155 to disease-prone regions of arteries provides a novel mechanism by which neutrophils contribute to vascular inflammation and atherogenesis.

Abstract Fibrinogen is essential for blood coagulation. The C-terminus of the fibrinogen α-chain (αC-region) is composed of an αC-domain and αC-connector. Two recombinant fibrinogen variants (α390 and α220) were produced to investigate the role of subregions in modulating clot stability and resistance to lysis. The α390 variant, truncated before the αC-domain, produced clots with a denser structure and thinner fibres. In contrast, the α220 variant, truncated at the start of the αC-connector, produced clots that were porous with short stunted fibres and visible fibre ends. These clots were mechanically weak and susceptible to lysis. Our data demonstrate differential effects for the αC-subregions in fibrin polymerisation, clot mechanical strength, and fibrinolytic susceptibility. Furthermore, we demonstrate that the αC-subregions are key for promoting longitudinal fibre growth. Together, these findings highlight critical functions of the αC-subregions in relation to clot structure and stability, with future implications for development of novel therapeutics for thrombosis.

 Introduction Atherosclerosis is the major underlying cause of heart attack and stroke and, as such, understanding the underlying pathological mechanisms of the disease remains a priority. Whilst neutrophils are the most abundant circulating leukocyte, they are rarely detected within developing plaques. Neutrophil microvesicles (NMVs), large (>0.1µm) extracellular vesicles derived from the plasma membrane, were shown to increase miR-155 in endothelial cells (ECs) at atheroprone sites. This led to exacerbation of plaque formation in a mouse model of atherosclerosis. We hypothesise that NMVs contain other microRNA (miRNA) that may influence atherosclerosis initiation and progression. 

Methods

 NMV were isolated from human peripheral blood neutrophils that were stimulated with 10 ng/mL native (n)LDL, 10 ng/mL oxidised (ox)LDL, or PBS only (unstimulated control). Small RNAs were isolated from NMV using miRNeasy mini kit (Qiagen, Germany) and quantity and quality of isolated RNA determined using NanoPhotometer® N60 spectrophotometer (Geneflow, UK) and a 2100 Bioanalyser (Agilent, UK). Small RNA sequencing analysis was performed using Illumina sequencing platform by Novogen, UK. Sequencing data was processed to obtain the clean reads that aligned to the human reference genome. Data was further processed and visualised using R software. 

Results

 757 miRNAs were detected in NMVs. Of these, 527 miRNAs were expressed in all NMV groups, 55 uniquely expressed in NMVs from n/oxLDL stimulated neutrophils and 36 only in unstimulated control NMVs. The most abundant miRNA in all samples was miR-148a-3p, a miRNA previously shown to enhance plaque formation. High levels of miR-155 were also detected in all samples. 

Conclusion

 NMVs have been found to contain a high abundance of miRNAs, with some expression dependent on the stimulus used for induction of MV release. Target and pathway analysis of these data are ongoing. miRNA previously shown to play a role in plaque formation were among the most highly abundant within NMV suggesting that NMV delivery of miRNA to atherosclerotic plaques may play an important role in exacerbating plaque formation. 

Conflict of Interest

 The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this poster.

Background

 Atherosclerotic plaque formation is the underlying cause of heart attack and stroke. Macrophages play a key role in plaque progression. Neutrophils are rarely detected in plaques but have been shown to play an integral role in plaque development. We have previously shown that microvesicles released from stimulated neutrophils are present in plaques and enhance plaque formation. Neutrophil microvesicles (NMV) have been found to modulate macrophage activity in atherosclerosis and are known to contain microRNA that can influence macrophage behaviour. We hypothesise that NMV can interact with macrophages within atherosclerotic plaques and alter macrophage phenotype and function. 

Methods

 To determine whether NMV can cross the endothelium, human coronary artery endothelial cells (HCAEC) were cultured ± TNF on transwell inserts. NMV were stained with PKH lipophilic membrane dye and added to the upper compartment of the transwells at ratios of 1:10, 1:50, and 1:100 HCAEC: NMV. After 24h NMV in the basal chamber were visualised using fluorescent microscopy and quantified using Fiji. To investigate NMV internalisation by macrophages, M0 human monocyte-derived macrophages (HMDM) were treated at a ratio of 1:100 HMDM:PKH stained NMV for periods of 24, 6 and 1h. Following treatment, NMV internalisation was quantified by flow cytometry and visualised using confocal microscopy. Trypan blue was used to quench surface fluorescence and distinguish between adherent and internalised NMV. Modulation of macrophage polarisation by NMV was assessed by RT- qPCR analysis of CD68, CD86, MRC1 and CD163 expression after 24h. 

Results

 NMV were able to cross the endothelium in a dose-dependent manner. NMV also interacted with both stimulated and unstimulated HCAECs. NMV interaction with HMDM occurred rapidly with approximately 10% HMDM being identified as PKH+ve after 1h. Internalization of NMVs by HMDMs increased over time with approximately 64% of PKH+ve cells containing NMV after 24h. However, incubation of HMDM with NMVs did not result in any significant changes in polarisation marker expression after 24h. 

Conclusions

 NMV can cross the endothelial monolayer and interact with macrophages. They are internalised by macrophages but are not able to induce changes in polarisation in the absence of other polarising stimuli. Further investigation is underway to elucidate the mechanisms of NMV internalisation and determine whether NMV can act synergistically with cytokines present in the plaque to influence macrophage polarisation. 

Conflict of Interest

 None