ABSTRACT To build complex genetic networks with predictable behaviours, synthetic biologists use libraries of modular parts that can be characterized in isolation and assembled together to create programmable higher-order functions. Characterization experiments and computational models for gene regulatory parts operating in isolation are routinely employed to predict the dynamics of interconnected parts and guide the construction of new synthetic devices. Here, we individually characterize two modes of RNA-based transcriptional regulation, using small transcription activating RNAs (STARs) and CRISPR interference (CRISPRi), and show how their distinct regulatory timescales can be used to engineer a composed feedforward loop that creates a pulse of gene expression. We use a cell-free transcription-translation system (TXTL) to rapidly characterize the system, and we apply Bayesian inference to extract kinetic parameters for an ODE-based mechanistic model. We then demonstrate in simulation and verify with TXTL experiments that the simultaneous regulation of a single gene target with STARs and CRISPRi leads to a pulse of gene expression. Our results suggest the modularity of the two regulators in an integrated genetic circuit, and we anticipate that construction and modeling frameworks that can leverage this modularity will become increasingly important as synthetic circuits increase in complexity.

The niche of microorganisms is determined by where their populations can expand. Populations can fail to grow because of high death or low birth rates, but these are challenging to measure in microorganisms. We developed a novel technique that enables single cell measurement of age-structured birth and death rates in the budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, and used this method to study responses to heat stress in a genetically diverse panel of strains. We find that individual cells show significant heterogeneity in their rates of birth and death during heat stress. Genotype-by-environment effects on processes that regulate asymmetric cell division contribute to this heterogeneity. These lead to either premature senescence or early life mortality during heat stress, and we find that a mitochondrial inheritance defect explains the early life mortality phenotype of one of the strains we studied. This study demonstrates how the interplay of physiology, genetic variation, and environmental variables influences where microbial populations survive and flourish.

The C. elegans insulin-like signaling network supports homeostasis and developmental plasticity. The genome encodes 40 insulin-like peptides and one receptor. Feedback regulation has been reported, but the extent of feedback and its effect on signaling dynamics during a state transition has not been determined. We measured mRNA expression for each insulin-like peptide, the receptor daf-2, components of the PI3K pathway, and its transcriptional effectors daf-16/FoxO and skn-1/Nrf at high temporal resolution during transition from a starved, quiescent state to a fed, growing state in wild type and mutants affecting daf-2/InsR and daf-16/FoxO. We also analyzed the effect of temperature on insulin-like gene expression. We found that numerous PI3K pathway components and insulin-like peptides are affected by signaling activity, revealing pervasive positive and negative feedback regulation. Reporter gene analysis demonstrated that the daf-2/InsR agonist daf-28 positively regulates its own expression and that other agonists cross-regulate daf-28 transcription through feedback. Our results show that feedback regulation of insulin-like signaling is widespread, suggesting a critical role of feedback in signaling dynamics in this endocrine network and likely others.

CRISPR-Cas systems have offered versatile technologies for genome engineering, yet their implementation has been outpaced by the ongoing discovery of new Cas nucleases and anti-CRISPR proteins. Here, we present the use of E. coli cell-free transcription-translation systems (TXTL) to vastly improve the speed and scalability of CRISPR characterization and validation. Unlike prior approaches that require protein purification or live cells, TXTL can express active CRISPR machinery from added plasmids and linear DNA, and TXTL can output quantitative dynamics of DNA cleavage and gene repression. To demonstrate the applicability of TXTL, we rapidly measure guide RNA-dependent DNA cleavage and gene repression for single- and multi-effector CRISPR-Cas systems, accurately predict the strength of gene repression in E. coli, quantify the inhibitory activity of anti-CRISPR proteins, and develop a fast and scalable high-throughput screen for protospacer-adjacent motifs. These examples underscore the potential of TXTL to facilitate the characterization and application of CRISPR technologies across their many uses.

Abstract The roundworm C. elegans transiently arrests larval development to survive extended starvation ( 1 ), but such early-life starvation reduces reproductive success ( 2, 3 ). Maternal dietary restriction (DR) buffers progeny from starvation, increasing reproductive success ( 4 ). It is unknown why early-life starvation decreases reproductive success and how maternal diet modifies this process. We show here that extended starvation in first-stage (L1) larvae followed by unrestricted feeding results in a variety of abnormalities in the reproductive system, including glp-1/ Notch-sensitive germ-cell tumors and uterine masses that express neuronal and epidermal markers. We found that maternal DR reduces the penetrance of starvation-induced abnormalities, including tumors. Furthermore, we show that maternal DR reduces insulin/IGF signaling (IIS) in progeny, and that daf-16 /FoxO and skn-1 /Nrf, transcriptional effectors of IIS, are required in progeny for maternal DR to suppress abnormalities. daf-16 /FoxO activity in somatic tissues is sufficient to suppress starvation-induced abnormalities, suggesting cell-nonautonomous regulation of reproductive system development. This work reveals complex inter- and intra-generational effects of nutrient availability mediated by IIS with consequences on developmental integrity and reproductive success. One Sentence Summary Intergenerational effects of diet on IIS

The role of phenotypic plasticity in the evolution of new traits is controversial due to a lack of direct evidence. Phage host-range becomes plastic in the presence of restriction-modification (R-M) systems in their hosts. I modeled the evolution of phage host-range in the presence of R-M systems. The model makes two main predictions. First, that offspring of the first phage to gain a new methylation pattern by infecting a new host make up a disproportionate fraction of the subsequent specialist population, indicating that the plastically-produced phenotype is highly predictive of evolutionary outcome. Second, that the first phage gain this pattern is not always genetically distinct from other phages in the population. Taken together, these results suggest that plasticity could play a causal role on par with mutation during the evolution of phage host range. This uniquely tractable system could enable the first direct test of 'plasticity first' evolution.