Anaerobic ammonium oxidizing (anammox) bacteria are detected in many natural ecosystems and wastewater treatment plants worldwide. This study describes the enrichment of anammox bacteria in the presence of acetate. The results obtained extend the concept that the anammox bacteria can be enriched to high densities in the presence of substrates for heterotrophic growth. Batch experiments showed that among the tested biomass, the biomass from the Candidatus 'Brocadia fulgida' enrichment culture oxidizes acetate at the highest rate. Continuous cultivation experiments showed that in the presence of acetate, ammonium, nitrite and nitrate, Candidatus 'Brocadia fulgida' out-competed other anammox bacteria. The results indicated that Candidatus 'Brocadia fulgida' did not incorporate acetate directly into their biomass. Candidatus 'Brocadia fulgida' exhibited the common characteristics of anammox bacteria: the presence of an anammoxosome and ladderane lipids and the production of hydrazine in the presence of hydroxylamine. Interestingly, the biofilm aggregates of this species showed strong autofluorescence. It is the only known anammox species exhibiting this feature. The autofluorescent extracellular polymeric substance had two excitation (352 and 442 nm) and two emission (464 and 521 nm) maxima.

A Gram-positive staining, rod-shaped, non-motile, spore-forming obligately anaerobic bacterium, designated CRIB T , was isolated from the gastro-intestinal tract of a rat and characterized. The major cellular fatty acids of strain CRIB T were saturated and unsaturated straight-chain C 12 –C 19 fatty acids, with C 16 : 0 being the predominant fatty acid. The polar lipid profile comprised six glycolipids, four phospholipids and one lipid that did not stain with any of the specific spray reagents used. The only quinone was MK-6. The predominating cell-wall sugars were glucose and galactose. The peptidoglycan type of strain CRIB T was A1σ lanthionine-direct. The genomic DNA G+C content of strain CRIB T was 28.1 mol%. On the basis of 16S rRNA gene sequence similarity, strain CRIB T was most closely related to a number of species of the genus Clostridium , including Clostridium lituseburense (97.2 %), Clostridium glycolicum (96.2 %), Clostridium mayombei (96.2 %), Clostridium bartlettii (96.0 %) and Clostridium irregulare (95.5 %). All these species show very low 16S rRNA gene sequence similarity (<85 %) to the type strain of Clostridium butyricum , the type species of the genus Clostridium . DNA–DNA hybridization with closely related reference strains indicated reassociation values below 32 %. On the basis of phenotypic and genetic studies, a novel genus, Romboutsia gen. nov., is proposed. The novel isolate CRIB T ( = DSM 25109 T = NIZO 4048 T ) is proposed as the type strain of the type species, Romboutsia ilealis gen. nov., sp. nov., of the proposed novel genus. It is proposed that C. lituseburense is transferred to this genus as Romboutsia lituseburensis comb. nov. Furthermore, the reclassification into novel genera is proposed for C. bartlettii , as Intestinibacter bartlettii gen. nov., comb. nov. (type species of the genus), C. glycolicum , as Terrisporobacter glycolicus gen. nov., comb. nov. (type species of the genus), C. mayombei , as Terrisporobacter mayombei gen. nov., comb. nov., and C. irregulare , as Asaccharospora irregularis gen. nov., comb. nov. (type species of the genus), on the basis of additional data collected in this study. In addition, an emendation of the species Peptostreptococcus anaerobius and the order Eubacteriales is provided.

Anaerobic ammonium oxidation (anammox) bacteria contribute significantly to the global nitrogen cycle and play a major role in sustainable wastewater treatment. Anammox bacteria convert ammonium (NH4+) to dinitrogen gas (N2) using intracellular electron acceptors such as nitrite (NO2−) or nitric oxide (NO). However, it is still unknown whether anammox bacteria have extracellular electron transfer (EET) capability with transfer of electrons to insoluble extracellular electron acceptors. Here we show that freshwater and marine anammox bacteria couple the oxidation of NH4+ with transfer of electrons to insoluble extracellular electron acceptors such as graphene oxide or electrodes in microbial electrolysis cells. 15N-labeling experiments revealed that NH4+ was oxidized to N2 via hydroxylamine (NH2OH) as intermediate, and comparative transcriptomics analysis revealed an alternative pathway for NH4+ oxidation with electrode as electron acceptor. Complete NH4+ oxidation to N2 without accumulation of NO2− and NO3− was achieved in EET-dependent anammox. These findings are promising in the context of implementing EET-dependent anammox process for energy-efficient treatment of nitrogen. Bacteria capable of anaerobic ammonium oxidation (anammox) produce half of the nitrogen gas in the atmosphere, but much of their physiology is still unknown. Here the authors show that anammox bacteria are capable of a novel mechanism of ammonium oxidation using extracellular electron transfer.

Abstract Planctomycetes are intriguing microorganisms that apparently lack peptidoglycan, a structure that controls the shape and integrity of almost all bacterial cells. Therefore, the planctomycetal cell envelope is considered exceptional and their cell plan uniquely compartmentalized. Anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) Planctomycetes play a key role in the global nitrogen cycle by releasing fixed nitrogen back to the atmosphere as N 2 . Here using a complementary array of state-of-the-art techniques including continuous culturing, cryo-transmission electron microscopy, peptidoglycan-specific probes and muropeptide analysis, we show that the anammox bacterium Kuenenia stuttgartiensis contains peptidoglycan. On the basis of the thickness, composition and location of peptidoglycan in K. stuttgartiensis , we propose to redefine Planctomycetes as Gram-negative bacteria. Our results demonstrate that Planctomycetes are not an exception to the universal presence of peptidoglycan in bacteria.

Abstract Anaerobic ammonium oxidizing bacteria make a living oxidizing ammonium with nitrite as electron acceptor, intermediates nitric oxide and hydrazine, and end product dinitrogen gas. Hydrazine is a biologically unique free intermediate in this metabolism, and is produced by the enzyme hydrazine synthase. Crystallization of ‘ Candidatus Kuenenia stuttgartiensis’ hydrazine synthase allowed for an initial hypothesis of its reaction mechanism. In this hypothesis, nitric oxide is first reduced to hydroxylamine after which hydroxylamine is condensed with ammonium to form hydrazine. Hydrazine synthase is a tetraheme cytochrome c , containing two proposed active site hemes (γI & αI) in the γ- and α-subunit, respectively, connected by an intra-enzymatic tunnel. Here we combined the data from electrochemistry-induced Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, EPR and optical spectroscopy to shed light on the redox properties and protein dynamics of hydrazine synthase in the context of its reaction mechanism. Redox titrations revealed two low potential low spin hemes with midpoint potentials of ∼-360 mV and ∼-310 mV for heme αII and γII, respectively. Heme γI showed redox transitions in the range of 0 mV, consisting of both low spin and high spin characteristics in optical and EPR spectroscopy. Electrochemistry-induced FTIR spectroscopy indicated an aspartic acid ligating a OH - /H 2 O at the heme γI axial site as a possible candidate for involvement in this mixed spin characteristic. Furthermore, EPR spectroscopy confirmed the ability of heme γI to bind NO in the reduced state. Heme αI exhibited a rhombic high spin signal, in line with its ligation by a proximal tyrosine observed in the crystal structure. Redox titrations down to −610 mV nor addition of dithionite resulted in the reduction of heme αI, indicating a very low midpoint potential for this heme. In vivo chemistry at this heme αI, the candidate for the comproportionation of hydroxylamine and ammonium, is thus likely to be initiated solely on the oxidized heme, in contrast to previously reported DFT calculations. The reduction potentials of the γ-subunit hemes were in line with the proposed electron transfer of heme γII to heme γI for the reduction of NO to hydroxylamine (E 0 ’ = − 30 mV).

Anaerobic ammonium oxidation (anammox) by anammox bacteria contributes significantly to the global nitrogen cycle, and plays a major role in sustainable wastewater treatment. Anammox bacteria convert ammonium (NH4+) to dinitrogen gas (N2) using nitrite (NO2-) or nitric oxide (NO) as the electron acceptor. In the absence of NO2- or NO, anammox bacteria can couple formate oxidation to the reduction of metal oxides such as Fe(III) or Mn(IV). Their genomes contain homologs of Geobacter and Shewanella cytochromes involved in extracellular electron transfer (EET). However, it is still unknown whether anammox bacteria have EET capability and can couple the oxidation of NH4+ with transfer of electrons to carbon-based insoluble extracellular electron acceptors. Here we show using complementary approaches that in the absence of NO2-, freshwater and marine anammox bacteria couple the oxidation of NH4+ with transfer of electrons to carbon-based insoluble extracellular electron acceptors such as graphene oxide (GO) or electrodes poised at a certain potential in microbial electrolysis cells (MECs). Metagenomics, fluorescence in-situ hybridization and electrochemical analyses coupled with MEC performance confirmed that anammox electrode biofilms were responsible for current generation through EET-dependent oxidation of NH4+. 15N-labelling experiments revealed the molecular mechanism of the EET-dependent anammox process. NH4+ was oxidized to N2 via hydroxylamine (NH2OH) as intermediate when electrode was the terminal electron acceptor. Comparative transcriptomics analysis supported isotope labelling experiments and revealed an alternative pathway for NH4+ oxidation coupled to EET when electrode is used as electron acceptor compared to NO2- as electron acceptor. To our knowledge, our results provide the first experimental evidence that marine and freshwater anammox bacteria can couple NH4+ oxidation with EET, which is a significant finding, and challenges our perception of a key player of anaerobic oxidation of NH4+ in natural environments and engineered systems.

The application of partial nitritation-anammox (PN/A) under mainstream conditions can enable substantial cost savings at wastewater treatment plants (WWTPs), but how process conditions and cell physiology affect anammox performance at psychrophilic temperatures below 15 C remains poorly understood. We tested 14 anammox communities, including 8 from globally-installed PN/A processes, for (i) specific activity at 10-30 C (batch assays), (ii) composition of membrane lipids (U-HPLC-HRMS/MS), and (iii) microbial community structure (16S rRNA gene amplicon sequencing). Crucially, the key parameters impacting anammox activity were the membrane lipid composition and cultivation temperature. The size of ladderane lipids and the content of bacteriohopanoids were key physiological drivers of anammox performance at low temperatures. Higher contents of (i) short C18 [3]-ladderane alkyl and (ii) large phosphatidylcholine headgroup were determined in anammox more active at 15-30 C and 10-15 C, respectively. At below 15 C, the activation energies of most mesophilic cultures severely increased while those of the psychrophilic cultures remained stable; this indicates that the adaptation of mesophilic cultures to psychrophilic regime necessitates months, but in some cases can take up to 5 years. Interestingly, biomass enriched in the marine genus Candidatus Scalindua displayed exceptionally highest activity at 10-20 C (0.50 kg-N.kg-VSS-1.d-1 at 10 C, Ea10-30 C = 51+-16 kJ.mol-1), indicating outstanding potential for nitrogen removal from cold streams. Collectively, our comprehensive study provides essential knowledge of cold adaptation mechanism, will enable more accurate modelling and suggests highly promising target anammox genera for inoculation and set-up of anammox reactors, in particular for mainstream WWTPs.