ABSTRACT Kcc2 plays a critical role in determining the efficacy of synaptic inhibition, however, the cellular mechanism neurons use to regulate its membrane trafficking, stability and activity are ill-defined. To address these issues, we used affinity purification to isolate stable multi-protein complexes of Kcc2 from the plasma membrane of murine forebrain. We resolved these using Blue-native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) coupled to LC-MS/MS. Purified Kcc2 migrated as distinct molecular species of 300, 600 and 800 kDa following BN-PAGE. In excess of 90% coverage of the soluble N and C-termini of Kcc2 was obtained. The 300kDa species largely contained Kcc2, which is consistent with a dimeric quaternary structure for this transporter. Intriguingly, lower levels of Kcc1 were also found in this species suggesting the existence of “mixed” Kcc2/Kcc1 heterodimers. The 600 and 800 kDa species represented stable multi-protein complexes of Kcc2. We identified a set of novel structural, ion transporting and signaling protein interactors, that are present at both excitatory and inhibitory synapses, consistent with the proposed association of Kcc2. These included spectrins, ankyrins, and the IP3 receptor. We also identified interactors more directly associated with phosphorylation; Akap5 and Lmtk3. Finally, we used LC-MS/MS on highly purified endogenous plasma membrane Kcc2 to detect phosphorylation sites. We detected 11 sites with high confidence, including known and novel sites. Collectively our experiments demonstrate that Kcc2 is associated with components of the neuronal cytoskeleton and signaling molecules that may act to regulate transporter membrane trafficking, stability, and activity.

ABSTRACT The K+/Cl– co-transporter KCC2 (SLC12A5) allows mature neurons in the CNS to maintain low intracellular Cl − levels that are critical in mediating fast hyperpolarizing synaptic inhibition via type A γ-aminobutyric acid receptors GABA A Rs. In accordance with this, compromised KCC2 activity results in seizures but whether such deficits directly contribute to the subsequent changes in neuronal viability that lead to epileptogenesis, remains to be assessed. Canonical hyperpolarizing GABA A R currents develop postnatally which reflect a progressive increase in KCC2 expression levels and activity. To investigate the role that KCC2 plays in regulating neuronal viability and architecture we have conditionally ablated KCC2 expression in developing and mature neurons. Decreasing KCC2 expression resulted in the rapid activation of the extrinsic apoptotic pathway, in mature hippocampal neurons. Intriguingly, direct pharmacological inhibition of KCC2 in mature neurons resulted in the rapid activation of the extrinsic apoptotic pathway. In contrast, ablating KCC2 expression in immature neurons had no discernable effects on their subsequent development, arborization or dendritic structure. However ablating KCC2 expression in immature neurons was sufficient to prevent the subsequent postnatal development of hyperpolarizing GABA A R currents. Collectively, our results demonstrate that KCC2 plays a critical role in neuronal survival by limiting apoptosis, and mature neurons are highly sensitive to loss of KCC2 function. In contrast KCC2 appears to play a minimal role in mediating neuronal development or architecture.

Alkaline water splitting (AWS) is one of the most attractive technologies for green hydrogen production. In comparison to the acidic proton exchange membrane (PEM), AWS offers greater flexibility in using non-platinum group metal catalysts and could generate higher-purity hydrogen. However, commercial AWS systems are normally operated at a lower current density (~400 mA cm -2 ) than PEM electrolyzers. To rapidly generate hydrogen at an industrial scale, it is critical to boost the operating current density of AWS to a level of ~1000 mA cm -2 . Nevertheless, the significant amount of gas bubbles generated during high-rate AWS could be detrimental to the process. Bubbles can block the catalysts’ active site, hinder electrolyte diffusion, and increase Ohmic resistance, thus deteriorating the reaction rate and restricting the cell voltage efficiency. The detachment of gas bubbles may also damage the catalyst layer. In this study, we demonstrate a general strategy for facilitating bubble detachment by modifying the nickel electrode surface with nickel nanocone nanostructures, which turns the surface into underwater superaerophobic. The simulation and experimental data show that bubbles take a considerably shorter time to detach from the nanocone-modified nickel foil than the unmodified foil. As a result, these bubbles also have a smaller detachment size and less chance for bubble coalescence. The nanocone-modified electrodes, including nickel foil, nickel foam, and 3D-printed nickel lattice, all show substantially reduced overpotentials at 1000 mA cm -2 compared to their pristine counterpart. The electrolyzer assembled with two nanocone-modified nickel lattice electrodes retains >95% of the performance after testing at ~900 mA cm -2 for 100 hours and the surface NC structure is also well preserved, demonstrating its excellent electrochemical and mechanical stability at high current density. Our findings offer an exciting and simple strategy for enhancing the bubble detachment and, thus, the electrode activity for high-rate AWS.

KCC2 plays a critical role in determining the efficacy of synaptic inhibition and deficits in its activity lead to epilepsy and neurodevelopmental delay. Here we use unbiased proteomic analyses to demonstrate that KCC2 forms stable protein complexes in the neuronal plasma membrane with 96 autism and/or epilepsy risk gene (ASD/Epi) products including ANKB, ANKG, CNTN1, ITPR1, NCKAP1, SCN2A, SHANK3, SPTAN1, and SPTBN1. Many of these proteins are also targets of Fragile-X mental retardation protein (FMRP), the inactivation of which is the leading monogenic cause of autism. Accordingly, the expression of a subset of these KCC2-binding partners was decreased in Fmr1 knockout mice. Fmr1 knockout compromised KCC2 phosphorylation, a key regulatory mechanism for transporter activity and the postnatal development of GABAergic inhibition. Thus, KCC2 is a point of convergence for multiple ASD/Epi risk genes and therapies targeting this transporter may have broad utility in alleviating these heterogeneous disorders and their associated epilepsies.