Background. Despite the availability of published data on 4 pandemics that have occurred over the past 120 years, there is little modern information on the causes of death associated with influenza pandemics.

Abstract The "Spanish" influenza pandemic of 1918–1919, which caused ≈50 million deaths worldwide, remains an ominous warning to public health. Many questions about its origins, its unusual epidemiologic features, and the basis of its pathogenicity remain unanswered. The public health implications of the pandemic therefore remain in doubt even as we now grapple with the feared emergence of a pandemic caused by H5N1 or other virus. However, new information about the 1918 virus is emerging, for example, sequencing of the entire genome from archival autopsy tissues. But, the viral genome alone is unlikely to provide answers to some critical questions. Understanding the 1918 pandemic and its implications for future pandemics requires careful experimentation and in-depth historical analysis.

The pandemic influenza virus of 1918–1919 killed an estimated 20 to 50 million people worldwide. With the recent availability of the complete 1918 influenza virus coding sequence, we used reverse genetics to generate an influenza virus bearing all eight gene segments of the pandemic virus to study the properties associated with its extraordinary virulence. In stark contrast to contemporary human influenza H1N1 viruses, the 1918 pandemic virus had the ability to replicate in the absence of trypsin, caused death in mice and embryonated chicken eggs, and displayed a high-growth phenotype in human bronchial epithelial cells. Moreover, the coordinated expression of the 1918 virus genes most certainly confers the unique high-virulence phenotype observed with this pandemic virus.

Understanding the origin and virulence of the virus that caused 1918–19 influenza pandemic is vital, not least because of the risk that a similar virus could arise in the human population. No isolates of the virus were made in 1918, so direct study was not possible, but a project to sequence its genome was begun in 1995, using RNA fragments from autopsy tissues of victims of the pandemic. Now, with the coding sequences of the viral polymerase complex established, that sequence is complete. These data and other recent results suggest that the 1918 virus was an avian strain that adapted to humans, a sobering thought at a time when human cases of the H5N1 avian virus have been reported in Indonesia. Also out this week (on Nature online) is the first report from a large US project that is using novel sequencing techniques to capture the entire genome of modern influenza virus isolates. The first batch of data, to be made publicly available as a baseline for future studies, includes the genomes of 209 influenza isolates. Already the data point to mutations and segment exchanges that might lead to new viruses. The influenza A viral heterotrimeric polymerase complex (PA, PB1, PB2) is known to be involved in many aspects of viral replication and to interact with host factors1, thereby having a role in host specificity2,3. The polymerase protein sequences from the 1918 human influenza virus differ from avian consensus sequences at only a small number of amino acids, consistent with the hypothesis that they were derived from an avian source shortly before the pandemic. However, when compared to avian sequences, the nucleotide sequences of the 1918 polymerase genes have more synonymous differences than expected, suggesting evolutionary distance from known avian strains. Here we present sequence and phylogenetic analyses of the complete genome of the 1918 influenza virus4,5,6,7,8, and propose that the 1918 virus was not a reassortant virus (like those of the 1957 and 1968 pandemics9,10), but more likely an entirely avian-like virus that adapted to humans. These data support prior phylogenetic studies suggesting that the 1918 virus was derived from an avian source11. A total of ten amino acid changes in the polymerase proteins consistently differentiate the 1918 and subsequent human influenza virus sequences from avian virus sequences. Notably, a number of the same changes have been found in recently circulating, highly pathogenic H5N1 viruses that have caused illness and death in humans and are feared to be the precursors of a new influenza pandemic. The sequence changes identified here may be important in the adaptation of influenza viruses to humans.

The hemagglutinin (HA) structure at 2.9 angstrom resolution, from a highly pathogenic Vietnamese H5N1 influenza virus, is more related to the 1918 and other human H1 HAs than to a 1997 duck H5 HA. Glycan microarray analysis of this Viet04 HA reveals an avian alpha2-3 sialic acid receptor binding preference. Introduction of mutations that can convert H1 serotype HAs to human alpha2-6 receptor specificity only enhanced or reduced affinity for avian-type receptors. However, mutations that can convert avian H2 and H3 HAs to human receptor specificity, when inserted onto the Viet04 H5 HA framework, permitted binding to a natural human alpha2-6 glycan, which suggests a path for this H5N1 virus to gain a foothold in the human population.

The evolutionary interaction between influenza A virus and the human immune system, manifest as 'antigenic drift' of the viral haemagglutinin, is one of the best described patterns in molecular evolution. However, little is known about the genome-scale evolutionary dynamics of this pathogen. Similarly, how genomic processes relate to global influenza epidemiology, in which the A/H3N2 and A/H1N1 subtypes co-circulate, is poorly understood. Here through an analysis of 1,302 complete viral genomes sampled from temperate populations in both hemispheres, we show that the genomic evolution of influenza A virus is characterized by a complex interplay between frequent reassortment and periodic selective sweeps. The A/H3N2 and A/H1N1 subtypes exhibit different evolutionary dynamics, with diverse lineages circulating in A/H1N1, indicative of weaker antigenic drift. These results suggest a sink-source model of viral ecology in which new lineages are seeded from a persistent influenza reservoir, which we hypothesize to be located in the tropics, to sink populations in temperate regions.

The “Spanish” influenza pandemic killed at least 20 million people in 1918–1919, making it the worst infectious pandemic in history. Understanding the origins of the 1918 virus and the basis for its exceptional virulence may aid in the prediction of future influenza pandemics. RNA from a victim of the 1918 pandemic was isolated from a formalin-fixed, paraffin-embedded, lung tissue sample. Nine fragments of viral RNA were sequenced from the coding regions of hemagglutinin, neuraminidase, nucleoprotein, matrix protein 1, and matrix protein 2. The sequences are consistent with a novel H1N1 influenza A virus that belongs to the subgroup of strains that infect humans and swine, not the avian subgroup.

Influenza's Cryptic Constraint Because of the well-known pandemic potential of influenza viruses, it is important to understand the range of molecular interactions between the virus and its host. Despite years of intensive research on the virus, Jagger et al. (p. 199 , published online 28 June; see the Perspective by Yewdell and Ince ) have found that the influenza A virus has been hiding a gene in its small negative-sense RNA genome. An overlapping open reading frame was found contained in the PA viral RNA polymerase gene, which is accessed by ribosomal frameshifting to produce a fusion protein containing the N-terminal messenger RNA (mRNA) endonuclease domain of PA and an alternative C-terminal X domain. The resulting polypeptide, PA-X, selectively degrades host mRNAs and, in a mouse model of infection, modulated cellular immune responses, thus limiting viral pathogenesis.

The “Spanish” influenza pandemic killed over 20 million people in 1918 and 1919, making it the worst infectious pandemic in history. Here, we report the complete sequence of the hemagglutinin (HA) gene of the 1918 virus. Influenza RNA for the analysis was isolated from a formalin-fixed, paraffin-embedded lung tissue sample prepared during the autopsy of a victim of the influenza pandemic in 1918. Influenza RNA was also isolated from lung tissue samples from two additional victims of the lethal 1918 influenza: one formalin-fixed, paraffin-embedded sample and one frozen sample obtained by in situ biopsy of the lung of a victim buried in permafrost since 1918. The complete coding sequence of the A/South Carolina/1/18 HA gene was obtained. The HA1 domain sequence was confirmed by using the two additional isolates (A/New York/1/18 and A/Brevig Mission/1/18). The sequences show little variation. Phylogenetic analyses suggest that the 1918 virus HA gene, although more closely related to avian strains than any other mammalian sequence, is mammalian and may have been adapting in humans before 1918.

Influenza A virus specificity for the host is mediated by the viral surface glycoprotein hemagglutinin (HA), which binds to receptors containing glycans with terminal sialic acids. Avian viruses preferentially bind to α2-3-linked sialic acids on receptors of intestinal epithelial cells, whereas human viruses are specific for the α2-6 linkage on epithelial cells of the lungs and upper respiratory tract. To define the receptor preferences of a number of human and avian H1 and H3 viruses, including the 1918 H1N1 pandemic strains, their hemagglutinins were analyzed using a recently described glycan array. The array, which contains 200 carbohydrates and glycoproteins, not only revealed clear differentiation of receptor preferences for α2-3 and/or α2-6 sialic acid linkage, but could also detect fine differences in HA specificity, such as preferences for fucosylation, sulfation and sialylation at positions 2 (Gal) and 3 (GlcNAc, GalNAc) of the terminal trisaccharide. For the two 1918 HA variants, the South Carolina (SC) HA (with Asp190, Asp225) bound exclusively α2-6 receptors, while the New York (NY) variant, which differed only by one residue (Gly225), had mixed α2-6/α2-3 specificity, especially for sulfated oligosaccharides. Only one mutation of the NY variant (Asp190Glu) was sufficient to revert the HA receptor preference to that of classical avian strains. Thus, the species barrier, as defined by the receptor specificity preferences of 1918 human viruses compared to likely avian virus progenitors, can be circumvented by changes at only two positions in the HA receptor binding site. The glycan array thus provides highly detailed profiles of influenza receptor specificity that can be used to map the evolution of new human pathogenic strains, such as the H5N1 avian influenza.