Oxidized phospholipids (OxPLs) on apolipoprotein B-100 (apoB-100) particles are strongly associated with lipoprotein [a] (Lp[a]). In this study, we evaluated whether Lp[a] is preferentially the carrier of OxPL in human plasma. The content of OxPL on apoB-100 particles was measured with monoclonal antibody E06, which recognizes the phosphocholine (PC) headgroup of oxidized but not native phospholipids. To assess whether OxPLs were preferentially bound by Lp[a] as opposed to other lipoproteins, immunoprecipitation and ultracentrifugation experiments, in vitro transfer studies, and chemiluminescent ELISAs were performed. Immunoprecipitation of Lp[a] from human plasma with an apolipoprotein [a] (apo[a])-specific antibody demonstrated that more than 85% of E06 reactivity (i.e., OxPL) coimmunoprecipitated with Lp[a]. Ultracentrifugation experiments showed that nearly all OxPLs were found in fractions containing apo[a], as opposed to other apolipoproteins. In vitro transfer studies showed that oxidized LDL preferentially donates OxPLs to Lp[a], as opposed to LDL, in a time- and temperature-dependent manner, even in aqueous buffer. Approximately 50% of E06 immunoreactivity could be extracted from isolated Lp[a] following exposure of plasma to various lipid solvents. These data demonstrate that Lp[a] is the preferential carrier of PC-containing OxPL in human plasma. This unique property of Lp[a] suggests novel insights into its physiological function and mechanisms of atherogenicity. Oxidized phospholipids (OxPLs) on apolipoprotein B-100 (apoB-100) particles are strongly associated with lipoprotein [a] (Lp[a]). In this study, we evaluated whether Lp[a] is preferentially the carrier of OxPL in human plasma. The content of OxPL on apoB-100 particles was measured with monoclonal antibody E06, which recognizes the phosphocholine (PC) headgroup of oxidized but not native phospholipids. To assess whether OxPLs were preferentially bound by Lp[a] as opposed to other lipoproteins, immunoprecipitation and ultracentrifugation experiments, in vitro transfer studies, and chemiluminescent ELISAs were performed. Immunoprecipitation of Lp[a] from human plasma with an apolipoprotein [a] (apo[a])-specific antibody demonstrated that more than 85% of E06 reactivity (i.e., OxPL) coimmunoprecipitated with Lp[a]. Ultracentrifugation experiments showed that nearly all OxPLs were found in fractions containing apo[a], as opposed to other apolipoproteins. In vitro transfer studies showed that oxidized LDL preferentially donates OxPLs to Lp[a], as opposed to LDL, in a time- and temperature-dependent manner, even in aqueous buffer. Approximately 50% of E06 immunoreactivity could be extracted from isolated Lp[a] following exposure of plasma to various lipid solvents. These data demonstrate that Lp[a] is the preferential carrier of PC-containing OxPL in human plasma. This unique property of Lp[a] suggests novel insights into its physiological function and mechanisms of atherogenicity. Lipoprotein [a] (Lp[a]) was discovered more than 40 years ago by Kare Berg (1Berg K. A new serum type system in man—the LP system.Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1963; 59: 369-382Crossref PubMed Scopus (1015) Google Scholar) and consists of an LDL particle to which is attached the carbohydrate-rich apolipoprotein [a] (apo[a]). The apo[a] gene encodes a variable number of tri-loop structures called kringles (K) stabilized by three disulfide bonds. Apo[a] consists of KIV, KV, and an inactive protease-like domain. Cysteine 4057 of KIV-9 of apo[a] and cysteine 4326 of apolipoprotein B-100 (apoB-100) form a disulfide bond to create an Lp[a] particle (2Hobbs H.H. White A.L. Lipoprotein(a): intrigues and insights.Curr. Opin. Lipidol. 1999; 10: 225-236Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar, 3Scanu A.M. Nakajima K. Edelstein C. Apolipoprotein(a): structure and biology.Front. Biosci. 2001; 6: D546-D554Crossref PubMed Google Scholar, 4Utermann G. The mysteries of lipoprotein(a).Science. 1989; 246: 904-910Crossref PubMed Scopus (1090) Google Scholar, 5Kostner K.M. Kostner G.M. Lipoprotein(a): still an enigma?.Curr. Opin. Lipidol. 2002; 13: 391-396Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar, 6Berglund L. Ramakrishnan R. Lipoprotein(a): An elusive cardiovascular risk factor.Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004; 24: 2219-2226Crossref PubMed Scopus (192) Google Scholar). The clinical interest in Lp[a] emanates from its association with cardiovascular disease (CVD) when present in high plasma concentrations. A meta-analysis of prospective studies demonstrated that elevated levels of Lp[a] are an independent risk factor for CVD (7Danesh J. Collins R. Peto R. Lipoprotein(a) and coronary artery disease. Metaanalysis of prospective studies.Circulation. 2000; 102: 1082-1085Crossref PubMed Scopus (804) Google Scholar). The pro-atherogenic influence of Lp[a] seems to be particularly enhanced in subjects with elevated levels of LDL cholesterol (8Tsimikas S. Brilakis E.S. Miller E.R. McConnell J.P. Lennon R.J. Kornman K.S. Witztum J.L. Berger P.B. Oxidized phospholipids, Lp(a) lipoprotein, and coronary artery disease.N. Engl. J. Med. 2005; 353: 46-57Crossref PubMed Scopus (574) Google Scholar, 9Suk D.J. Rifai N. Buring J.E. Ridker P.M. Lipoprotein(a), measured with an assay independent of apolipoprotein(a) isoform size, and risk of future cardiovascular events among initially healthy women.J. Am. Med. Assoc. 2006; 296: 1363-1370Crossref PubMed Scopus (177) Google Scholar). The gene for apo[a] appeared recently on the evolutionary scale and is present only in humans and nonhuman primates. An unrelated apo[a]-like gene consisting only of KIII repeats is also present in hedgehogs and is postulated to have evolved independently through divergent evolution (10Lawn R.M. Boonmark N.W. Schwartz K. Lindahl G.E. Wade D.P. Byrne C.D. Fong K.J. Meer K. Patthy L. The recurring evolution of lipoprotein(a).J. Biol. Chem. 1995; 270: 24004-24009Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (80) Google Scholar). The physiological role of Lp[a] and the underlying mechanisms through which it contributes to CVD are unknown. One hypothesis suggests that Lp[a] promotes thrombosis by inhibiting thrombolysis. Apo[a] has high homology to plasminogen, but lacks the active catalytic protease domain of plasmin. Thus, it has been postulated to competitively inhibit the conversion of plasminogen to plasmin, and in vitro, Lp[a] inhibits thrombolysis (11Caplice N.M. Panetta C. Peterson T.E. Kleppe L.S. Mueske C.S. Kostner G.M. Broze Jr., G.J. Simari R.D. Lipoprotein (a) binds and inactivates tissue factor pathway inhibitor: a novel link between lipoproteins and thrombosis.Blood. 2001; 98: 2980-2987Crossref PubMed Scopus (163) Google Scholar). However, there is little evidence to support such a role in vivo. We have recently proposed the alternative hypothesis that a unique physiological role of Lp[a] may be to bind and transport proinflammatory oxidized phospholipids (OxPLs) (8Tsimikas S. Brilakis E.S. Miller E.R. McConnell J.P. Lennon R.J. Kornman K.S. Witztum J.L. Berger P.B. Oxidized phospholipids, Lp(a) lipoprotein, and coronary artery disease.N. Engl. J. Med. 2005; 353: 46-57Crossref PubMed Scopus (574) Google Scholar, 12Tsimikas S. Bergmark C. Beyer R.W. Patel R. Pattison J. Miller E. Juliano J. Witztum J.L. Temporal increases in plasma markers of oxidized low-density lipoprotein strongly reflect the presence of acute coronary syndromes.J. Am. Coll. Cardiol. 2003; 41: 360-370Crossref PubMed Scopus (305) Google Scholar, 13Edelstein C. Pfaffinger D. Hinman J. Miller E. Lipkind G. Tsimikas S. Bergmark C. Getz G.S. Witztum J.L. Scanu A.M. Lysine-phosphatidylcholine adducts in kringle V impart unique immunological and potential pro-inflammatory properties to human apolipoprotein(a).J. Biol. Chem. 2003; 278: 52841-52847Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (116) Google Scholar, 14Silaste M.L. Rantala M. Alfthan G. Aro A. Witztum J.L. Kesaniemi Y.A. Horkko S. Changes in dietary fat intake alter plasma levels of oxidized low-density lipoprotein and lipoprotein(a).Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004; 24: 498-503Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 15Tsimikas S. Lau H.K. Han K.R. Shortal B. Miller E.R. Segev A. Curtiss L.K. Witztum J.L. Strauss B.H. Percutaneous coronary intervention results in acute increases in oxidized phospholipids and lipoprotein(a): short-term and long-term immunologic responses to oxidized low-density lipoprotein.Circulation. 2004; 109: 3164-3170Crossref PubMed Scopus (209) Google Scholar, 16Tsimikas S. Witztum J.L. Miller E.R. Sasiela W.J. Szarek M. Olsson A.G. Schwartz G.G. High-dose atorvastatin reduces total plasma levels of oxidized phospholipids and immune complexes present on apolipoprotein B-100 in patients with acute coronary syndromes in the MIRACL trial.Circulation. 2004; 110: 1406-1412Crossref PubMed Scopus (180) Google Scholar, 17Rodenburg J. Vissers M.N. Wiegman A. Miller E.R. Ridker P.M. Witztum J.L. Kastelein J.J. Tsimikas S. Oxidized low-density lipoprotein in children with familial hypercholesterolemia and unaffected siblings: effect of pravastatin.J. Am. Coll. Cardiol. 2006; 47: 1803-1810Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 18Tsimikas S. Kiechl S. Willeit J. Mayr M. Miller E.R. Kronenberg F. Xu Q. Bergmark C. Weger S. Oberhollenzer F. et al.Oxidized phospholipids predict the presence and progression of carotid and femoral atherosclerosis and symptomatic cardiovascular disease: five-year prospective results from the Bruneck study.J. Am. Coll. Cardiol. 2006; 47: 2219-2228Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar, 19Kiechl S. Willeit J. Mayr M. Viehweider B. Oberhollenzer M. Kronenberg F. Wiedermann C.J. Oberthaler S. Xu Q. Witztum J.L. et al.Oxidized phospholipids, lipoprotein(a), lipoprotein-associated phospholipase A2 activity, and 10-year cardiovascular outcomes. Prospective results from the Bruneck Study.Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27: 1788-1795Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar). Thus, when present at low plasma concentrations, Lp[a] would actually be anti-inflammatory via its ability to bind OxPLs. The corollary to this is that one potential physiological role of Lp[a] is to bind OxPLs and either directly prevent their proinflammatory properties, or perhaps even enhance their degradation. In that regard, it may have some potential benefit at low plasma levels. This is supported by recent observations from our group in the Bruneck study (19Kiechl S. Willeit J. Mayr M. Viehweider B. Oberhollenzer M. Kronenberg F. Wiedermann C.J. Oberthaler S. Xu Q. Witztum J.L. et al.Oxidized phospholipids, lipoprotein(a), lipoprotein-associated phospholipase A2 activity, and 10-year cardiovascular outcomes. Prospective results from the Bruneck Study.Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27: 1788-1795Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar) and by two prior studies from Berg et al. (20Berg K. Dahlen G. Christophersen B. Cook T. Kjekshus J. Pedersen T. Lp(a) lipoprotein level predicts survival and major coronary events in the Scandinavian Simvastatin Survival Study.Clin. Genet. 1997; 52: 254-261Crossref PubMed Scopus (128) Google Scholar, 21Berg K. Ro O.C. Lp(a) lipoprotein level and longevity.Ann. Genet. 1991; 34: 264-269PubMed Google Scholar) showing a J-shaped relationship of Lp[a] to cardiovascular events, where patients with the lowest quartile of Lp[a] had a higher risk for cardiovascular events compared with subjects in the second quartile, but subjects in the third and fourth quartiles had much higher risk. Thus, when present at high plasma concentrations, Lp[a] would be more atherogenic than native LDL, because it binds with increased affinity to arterial intimal proteoglycans (22Pillarisetti S. Paka L. Obunike J.C. Berglund L. Goldberg I.J. Subendothelial retention of lipoprotein (a). Evidence that reduced heparan sulfate promotes lipoprotein binding to subendothelial matrix.J. Clin. Invest. 1997; 100: 867-874Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar), resulting in an increased intimal concentration of LDL, with associated proinflammatory OxPL. There is also indirect evidence from Tsironis et al. (23Tsironis L.D. Katsouras C.S. Lourida E.S. Mitsios J.V. Goudevenos J. Elisaf M. Tselepis A.D. Reduced PAF-acetylhydrolase activity associated with Lp(a) in patients with coronary artery disease.Atherosclerosis. 2004; 177: 193-201Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (31) Google Scholar) demonstrating reduced lipoprotein-associated phospholipase A2 activity on Lp[a], as opposed to on LDL from the same patients, suggesting that inability to degrade OxPL on Lp[a] may lead to coronary artery disease (CAD). Our hypothesis arose as a consequence of observations made when we initially developed a method to measure one class of OxPL in human plasma that was associated with apoB-100 (OxPL/apoB). This was accomplished using the murine monoclonal antibody E06, which is an IgM natural antibody that binds the phosphocholine (PC) headgroup of oxidized but not native phospholipids (24Hõrkkõ S. Bird D.A. Miller E. Itabe H. Leitinger N. Subbanagounder G. Berliner J.A. Friedman P. Dennis E.A. Curtiss L.K. et al.Monoclonal autoantibodies specific for oxidized phospholipids or oxidized phospholipid-protein adducts inhibit macrophage uptake of oxidized low-density lipoproteins.J. Clin. Invest. 1999; 103: 117-128Crossref PubMed Scopus (466) Google Scholar, 25Friedman P. Hörkkö S. Steinberg D. Witztum J.L. Dennis E.A. Correlation of antiphospholipid antibody recognition with the structure of synthetic oxidized phospholipids: importance of Schiff base formation and Aldol condensation.J. Biol. Chem. 2001; 277: 7010-7020Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (178) Google Scholar). E06 recognizes PC on an equimolar basis when present as a PC salt, or as PC present in OxPL, such as 1-palmitoyl-2-(5-oxovaleroyl)-sn-glycero-3-phosphorylcholine, present as a lipid, or if covalently attached (via the sn2 side chain) to a variety of different peptides, irrespective of amino acid sequence (25Friedman P. Hörkkö S. Steinberg D. Witztum J.L. Dennis E.A. Correlation of antiphospholipid antibody recognition with the structure of synthetic oxidized phospholipids: importance of Schiff base formation and Aldol condensation.J. Biol. Chem. 2001; 277: 7010-7020Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (178) Google Scholar). Using this assay, we have shown that plasma OxPL/apoB levels provide independent predictive value in quantitating the presence and extent of angiographically determined CAD (8Tsimikas S. Brilakis E.S. Miller E.R. McConnell J.P. Lennon R.J. Kornman K.S. Witztum J.L. Berger P.B. Oxidized phospholipids, Lp(a) lipoprotein, and coronary artery disease.N. Engl. J. Med. 2005; 353: 46-57Crossref PubMed Scopus (574) Google Scholar), identifying the presence and progression of carotid and femoral atherosclerosis (18Tsimikas S. Kiechl S. Willeit J. Mayr M. Miller E.R. Kronenberg F. Xu Q. Bergmark C. Weger S. Oberhollenzer F. et al.Oxidized phospholipids predict the presence and progression of carotid and femoral atherosclerosis and symptomatic cardiovascular disease: five-year prospective results from the Bruneck study.J. Am. Coll. Cardiol. 2006; 47: 2219-2228Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar), and also predicting CVD events over a 10 year interval (19Kiechl S. Willeit J. Mayr M. Viehweider B. Oberhollenzer M. Kronenberg F. Wiedermann C.J. Oberthaler S. Xu Q. Witztum J.L. et al.Oxidized phospholipids, lipoprotein(a), lipoprotein-associated phospholipase A2 activity, and 10-year cardiovascular outcomes. Prospective results from the Bruneck Study.Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007; 27: 1788-1795Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar). The OxPL/apoB ratio was independent of all known risk factors, except for Lp[a], and, remarkably, in all clinical studies performed thus far, there was an unusually strong correlation of OxPL/apoB with Lp[a] (R = ∼0.80–0.90) (8Tsimikas S. Brilakis E.S. Miller E.R. McConnell J.P. Lennon R.J. Kornman K.S. Witztum J.L. Berger P.B. Oxidized phospholipids, Lp(a) lipoprotein, and coronary artery disease.N. Engl. J. Med. 2005; 353: 46-57Crossref PubMed Scopus (574) Google Scholar, 12Tsimikas S. Bergmark C. Beyer R.W. Patel R. Pattison J. Miller E. Juliano J. Witztum J.L. Temporal increases in plasma markers of oxidized low-density lipoprotein strongly reflect the presence of acute coronary syndromes.J. Am. Coll. Cardiol. 2003; 41: 360-370Crossref PubMed Scopus (305) Google Scholar, 14Silaste M.L. Rantala M. Alfthan G. Aro A. Witztum J.L. Kesaniemi Y.A. Horkko S. Changes in dietary fat intake alter plasma levels of oxidized low-density lipoprotein and lipoprotein(a).Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004; 24: 498-503Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 15Tsimikas S. Lau H.K. Han K.R. Shortal B. Miller E.R. Segev A. Curtiss L.K. Witztum J.L. Strauss B.H. Percutaneous coronary intervention results in acute increases in oxidized phospholipids and lipoprotein(a): short-term and long-term immunologic responses to oxidized low-density lipoprotein.Circulation. 2004; 109: 3164-3170Crossref PubMed Scopus (209) Google Scholar, 16Tsimikas S. Witztum J.L. Miller E.R. Sasiela W.J. Szarek M. Olsson A.G. Schwartz G.G. High-dose atorvastatin reduces total plasma levels of oxidized phospholipids and immune complexes present on apolipoprotein B-100 in patients with acute coronary syndromes in the MIRACL trial.Circulation. 2004; 110: 1406-1412Crossref PubMed Scopus (180) Google Scholar, 17Rodenburg J. Vissers M.N. Wiegman A. Miller E.R. Ridker P.M. Witztum J.L. Kastelein J.J. Tsimikas S. Oxidized low-density lipoprotein in children with familial hypercholesterolemia and unaffected siblings: effect of pravastatin.J. Am. Coll. Cardiol. 2006; 47: 1803-1810Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 18Tsimikas S. Kiechl S. Willeit J. Mayr M. Miller E.R. Kronenberg F. Xu Q. Bergmark C. Weger S. Oberhollenzer F. et al.Oxidized phospholipids predict the presence and progression of carotid and femoral atherosclerosis and symptomatic cardiovascular disease: five-year prospective results from the Bruneck study.J. Am. Coll. Cardiol. 2006; 47: 2219-2228Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar). However, differences exist between Lp[a] mass and OxPL/apoB within different apo[a] isoform classes, with the strength of this correlation being weakest for the largest isoforms and strongest with the lowest number of kringle repeats (>29 repeats, r = 0.66; 23–29 repeats, r = 0.88; and <22 repeats, r = 0.93; P = 0.001 each) (18Tsimikas S. Kiechl S. Willeit J. Mayr M. Miller E.R. Kronenberg F. Xu Q. Bergmark C. Weger S. Oberhollenzer F. et al.Oxidized phospholipids predict the presence and progression of carotid and femoral atherosclerosis and symptomatic cardiovascular disease: five-year prospective results from the Bruneck study.J. Am. Coll. Cardiol. 2006; 47: 2219-2228Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar). These clinical observations suggest that OxPL may be bound to Lp[a] and may thereby mediate a common biological influence on CVD. However, the physical association of OxPL with Lp[a] has not been studied in detail. Therefore, the purpose of this study is to better define the association of OxPL with Lp[a] in human plasma using a variety of immunoprecipitation and ultracentrifugation experiments, in vitro transfer studies, and chemiluminescent ELISAs. Three groups of subjects were studied in the various experiments (Table 1). In study 1, plasma was repeatedly obtained from 1 subject with elevated Lp[a] levels, but without CVD, for immunoprecipitation and ultracentrifugation experiments; in study 2, plasma was obtained from 14 subjects without CVD for detailed ultracentrifugation experiments; and in study 3, plasma was obtained from 12 subjects with familial hypercholesterolemia undergoing apheresis, 9 of whom had a history of CVD.Table 1Baseline clinical characteristics of the three study groupsStudy 1Study 2Study 3Age (years)3851 ± 1044 ± 19Male/female1/011/46/6Body mass index25.126 ± 1.923 ± 4.5Cardiovascular disease, yes/no0/10/159/3Lipid parameters (mg/dl) Total cholesterol188189 ± 33225 ± 43 LDL-cholesterol121116 ± 32106 ± 54 HDL-cholesterol5641 ± 9.338 ± 10 Triglycerides53164 ± 97165 ± 33 Apolipoprotein A125N/D119 ± 23 Apolipoprotein B9085 ± 12125 ± 19 Lp[a] (median, 95% CI)11211.2 (7.6, 22.3)49.5 (40.0–75.7)Lp[a], lipoprotein [a]; N/D, not determined. Results are given as mean ± SD. Open table in a new tab Lp[a], lipoprotein [a]; N/D, not determined. Results are given as mean ± SD. Each of these studies was approved by the respective institutional review boards of the University of California San Diego, the Dyslipidemia and Atherosclerosis Research INSERM Unit 551, and the Children's Hospital Oakland Research Institute, respectively, and all subjects gave written informed consent. To assess whether OxPLs were physically associated with Lp[a] compared with other lipoproteins, plasma from the subject in study 1 with Lp[a] mass 112 mg/dl was diluted 1:50 in PBS in 1.5 ml conical, siliconized tubes in the presence of increasing amounts of LPA4 (molar ratio was based on molecular mass of LPA4 at 165 kDa and apo[a] at 500,000 kDa) to preferentially precipitate Lp[a]. LPA4 is a monoclonal IgG antibody binding the sequence TRNYCRNPDAEIRP on apo[a] and does not cross-react with plasminogen (15Tsimikas S. Lau H.K. Han K.R. Shortal B. Miller E.R. Segev A. Curtiss L.K. Witztum J.L. Strauss B.H. Percutaneous coronary intervention results in acute increases in oxidized phospholipids and lipoprotein(a): short-term and long-term immunologic responses to oxidized low-density lipoprotein.Circulation. 2004; 109: 3164-3170Crossref PubMed Scopus (209) Google Scholar). After a 24 h incubation at 4°C, samples were centrifuged for 20 min at 10,000 g, and 50 μl of the supernatant was added to microtiter wells coated with MB47, a murine monoclonal antibody that binds human apoB-100 (15Tsimikas S. Lau H.K. Han K.R. Shortal B. Miller E.R. Segev A. Curtiss L.K. Witztum J.L. Strauss B.H. Percutaneous coronary intervention results in acute increases in oxidized phospholipids and lipoprotein(a): short-term and long-term immunologic responses to oxidized low-density lipoprotein.Circulation. 2004; 109: 3164-3170Crossref PubMed Scopus (209) Google Scholar). To measure the amounts of OxPL or apo[a] remaining in the supernatant, biotinylated E06 or LPA4 was then added to wells in parallel plates, and the amounts bound were determined using chemiluminescent techniques, as previously described (15Tsimikas S. Lau H.K. Han K.R. Shortal B. Miller E.R. Segev A. Curtiss L.K. Witztum J.L. Strauss B.H. Percutaneous coronary intervention results in acute increases in oxidized phospholipids and lipoprotein(a): short-term and long-term immunologic responses to oxidized low-density lipoprotein.Circulation. 2004; 109: 3164-3170Crossref PubMed Scopus (209) Google Scholar). The data are expressed in relative light units (RLUs)/100 ms. To validate that equal numbers of apoB-100 particles were captured in each well, aliquots of the supernatants were added to MB47-coated wells in parallel control plates, and the amount of apoB-100 bound was measured using a biotinylated goat anti-human apoB-100 antibody (Biodesign International) as described above. Ultracentrifugation of plasma lipoprotein fractions was performed to assess which fractions contained E06 immunoreactivity. For this set of experiments, we used plasma from all three study groups using different isolation techniques: First, in study 1, lipoprotein fractions were separated into fractions with density <1.006, 1.006–1.020, 1.020–1.040, 1.040–1.060, 1.060–1.080, 1.080–1.110, and 1.110–1.210 g/ml and lipoprotein-deficient serum using sequential ultracentrifugation (26Witztum J.L. Young S.G. Elam R.L. Carew T.E. Fisher M. Cholestyramine-induced changes in low density lipoprotein composition and metabolism. I. Studies in the guinea pig.J. Lipid Res. 1985; 26: 92-103Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). This subject's lipid profile was: total cholesterol, 189 mg/dl; LDL-cholesterol (LDL-C), 121 mg/dl; HDL-C, 56 mg/dl; triglyceride, 53 mg/dl; and apoB-100, 90 mg/dl (Table 1). The densities of eluted fractions were verified using a DMA 45 Digital Density Meter (Anton Parr, Graz, Austria). Aliquots of equal amounts of protein (10 μg/ml) from each fraction were used to coat microtiter wells by overnight incubation at 4°C. The wells were then washed and the content of apoB-100, OxPL, and apo[a] determined with biotinylated goat anti-human apoB-100, E06, and LPA4, respectively, as described above. For study 2, we recruited 14 healthy normolipidemic male volunteers who were not on hypolipidemic agents, and were without overt CVD. Three density fractions were isolated over the LDL density interval of 1.033–1.064 g/ml to more finely assess the presence of OxPL in this density range. Blood samples were collected after an overnight fast into tubes containing 1 mg/ml EDTA and 10 μM Trolox. Plasma was adjusted to a density of 1.030 g/ml with sodium chloride-D2O solution and centrifuged at 40,000 rpm for 18 h at 10°C in a Beckman 40.3 Ti rotor. The top 2.0 ml was decanted, and the subnatant fluid was adjusted to a density of 1.063 g/ml with sodium chloride-D2O solution. After centrifugation at 10°C for 18 h at 40,000 rpm in a Beckman 40.3 Ti rotor, the LDL was withdrawn in the top 1.0 ml and dialyzed in a NaBr solution of 1.04 g/ml overnight with two changes of dialyzing solution. The dialyzed LDL (2.0 ml) was layered above a NaBr solution of density 1.0540 g/ml (2.5 ml), and 2.5 ml of a NaBr solution of density 1.0275 g/ml was layered above the LDL. The tubes were then centrifuged to equilibrium at 40,000 rpm for 40 h in a Beckman SW 45 rotor at 18°C. A blank tube containing salt with D2O was included with each ultracentrifugation for densitometric analysis of subfractions. The contents of each tube were then withdrawn by pipetting, and the first 2.5 ml (density <1.033 g/ml) and bottom 0.5 ml (density >1.064 g/ml) were discarded. The three sequential fractions used for compositional analysis were of density 1.033–1.038 g/ml (1.0 ml), 1.038–1.049 g/ml (1.5 ml), and 1.049–1.064 (1.5 ml). ApoB-100 levels were then determined in these fractions with a commercial assay. To directly determine the content of OxPL and apo[a] on apoB-100 particles in each fraction, MB47 was plated and equal amounts of apoB-100 (10 μg/ml) from each subfraction were then added. The amount of OxPL and apo[a] on apoB-100 was determined with biotinylated E06 and LPA4, respectively, as described above. The amount of apoB-100 bound in each well was determined using biotinylated goat anti-human apoB-100. As a third approach to assess the presence of OxPL over the entire lipoprotein density range, we recruited 12 patients with familial hypercholesterolemia, documented by both clinical and genetic testing, who were undergoing apheresis every 2–3 weeks. Density gradient ultracentrifugation was used to separate very narrow density bands of lipoproteins. These patients had a homogeneous lipoprotein profile except for differences in Lp[a] levels (Table 1). Plasma was fractionated on the basis of the hydrated density by the isopycnic ultracentrifugal density gradient procedure as described previously (27Chapman M.J. Goldstein S. Lagrange D. Laplaud P.M. A density gradient ultracentrifugal procedure for the isolation of the major lipoprotein classes from human serum.J. Lipid Res. 1981; 22: 339-358Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), with the modification that 2.5 ml (instead of 3 ml) of the 1.006 g/ml NaCl solution was added to the top of each gradient. Gradients were constructed in Ultraclear (Beckman) tubes of the Beckman SW41-Ti rotor (27Chapman M.J. Goldstein S. Lagrange D. Laplaud P.M. A density gradient ultracentrifugal procedure for the isolation of the major lipoprotein classes from human serum.J. Lipid Res. 1981; 22: 339-358Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Gentamycin (final concentration 50 mg/ml) and an antioxidant, EDTA (final concentration 0.26 mM), were also added to each “plasma-KBr” sample. Ultracentrifugation was performed in a Beckman L-80 ultracentrifuge at 40,000 rpm for 44 h at 15°C, using max acceleration and deceleration modes. Twenty-four fractions of 0.4 ml were collected successively from the meniscus of each tube with a Gilson precision pipette; however, the first fraction (d < 1.015 g/ml) was removed in the same volume with a narrow-bore Pasteur pipette in order to permit a more satisfactory separation of VLDL, which tended to adhere to the tube walls. Fifty μl aliquots from each fraction were used to coat microtiter wells by overnight incubation at 4°C. The wells were then washed and the content of apoB-100, OxPL, and apo[a] determined with biotinylated goat anti-human apoB-100, E06, and LPA4, respectively, as described above. To determine the relative capacity of LDL versus Lp[a] to bind OxPL, we compared the net transfer of OxPL, as measured by E06, from oxidized LDL (OxLDL) to either LDL or Lp[a] in a time- and temperature-dependent manner. LDL (with no Lp[a]) and Lp[a] to be used as acceptors were obtained using a lysine-sepharose column, as previously described (13Edelstein C. Pfaffinger D. Hinman J. Miller E. Lipkind G. Tsimikas S. Bergmark C. Getz G.S. Witztum J.L. Scanu A.M. Lysine-phosphatidylcholine adducts in kringle V impart unique immunological and potential pro-inflammatory properties to human apolipoprotein(a).J. Biol. Chem. 2003; 278: 52841-52847Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (116) Google Scholar). Each of these acceptor lipoproteins was biotinylated by standard methods (EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin; Pierce, Inc.). Donor lipoproteins consisted o

Regular, detailed reporting on population health by underlying cause of death is fundamental for public health decision making. Cause-specific estimates of mortality and the subsequent effects on life expectancy worldwide are valuable metrics to gauge progress in reducing mortality rates. These estimates are particularly important following large-scale mortality spikes, such as the COVID-19 pandemic. When systematically analysed, mortality rates and life expectancy allow comparisons of the consequences of causes of death globally and over time, providing a nuanced understanding of the effect of these causes on global populations.The Global Burden of Diseases, Injuries, and Risk Factors Study (GBD) 2021 cause-of-death analysis estimated mortality and years of life lost (YLLs) from 288 causes of death by age-sex-location-year in 204 countries and territories and 811 subnational locations for each year from 1990 until 2021. The analysis used 56 604 data sources, including data from vital registration and verbal autopsy as well as surveys, censuses, surveillance systems, and cancer registries, among others. As with previous GBD rounds, cause-specific death rates for most causes were estimated using the Cause of Death Ensemble model-a modelling tool developed for GBD to assess the out-of-sample predictive validity of different statistical models and covariate permutations and combine those results to produce cause-specific mortality estimates-with alternative strategies adapted to model causes with insufficient data, substantial changes in reporting over the study period, or unusual epidemiology. YLLs were computed as the product of the number of deaths for each cause-age-sex-location-year and the standard life expectancy at each age. As part of the modelling process, uncertainty intervals (UIs) were generated using the 2·5th and 97·5th percentiles from a 1000-draw distribution for each metric. We decomposed life expectancy by cause of death, location, and year to show cause-specific effects on life expectancy from 1990 to 2021. We also used the coefficient of variation and the fraction of population affected by 90% of deaths to highlight concentrations of mortality. Findings are reported in counts and age-standardised rates. Methodological improvements for cause-of-death estimates in GBD 2021 include the expansion of under-5-years age group to include four new age groups, enhanced methods to account for stochastic variation of sparse data, and the inclusion of COVID-19 and other pandemic-related mortality-which includes excess mortality associated with the pandemic, excluding COVID-19, lower respiratory infections, measles, malaria, and pertussis. For this analysis, 199 new country-years of vital registration cause-of-death data, 5 country-years of surveillance data, 21 country-years of verbal autopsy data, and 94 country-years of other data types were added to those used in previous GBD rounds.The leading causes of age-standardised deaths globally were the same in 2019 as they were in 1990; in descending order, these were, ischaemic heart disease, stroke, chronic obstructive pulmonary disease, and lower respiratory infections. In 2021, however, COVID-19 replaced stroke as the second-leading age-standardised cause of death, with 94·0 deaths (95% UI 89·2-100·0) per 100 000 population. The COVID-19 pandemic shifted the rankings of the leading five causes, lowering stroke to the third-leading and chronic obstructive pulmonary disease to the fourth-leading position. In 2021, the highest age-standardised death rates from COVID-19 occurred in sub-Saharan Africa (271·0 deaths [250·1-290·7] per 100 000 population) and Latin America and the Caribbean (195·4 deaths [182·1-211·4] per 100 000 population). The lowest age-standardised death rates from COVID-19 were in the high-income super-region (48·1 deaths [47·4-48·8] per 100 000 population) and southeast Asia, east Asia, and Oceania (23·2 deaths [16·3-37·2] per 100 000 population). Globally, life expectancy steadily improved between 1990 and 2019 for 18 of the 22 investigated causes. Decomposition of global and regional life expectancy showed the positive effect that reductions in deaths from enteric infections, lower respiratory infections, stroke, and neonatal deaths, among others have contributed to improved survival over the study period. However, a net reduction of 1·6 years occurred in global life expectancy between 2019 and 2021, primarily due to increased death rates from COVID-19 and other pandemic-related mortality. Life expectancy was highly variable between super-regions over the study period, with southeast Asia, east Asia, and Oceania gaining 8·3 years (6·7-9·9) overall, while having the smallest reduction in life expectancy due to COVID-19 (0·4 years). The largest reduction in life expectancy due to COVID-19 occurred in Latin America and the Caribbean (3·6 years). Additionally, 53 of the 288 causes of death were highly concentrated in locations with less than 50% of the global population as of 2021, and these causes of death became progressively more concentrated since 1990, when only 44 causes showed this pattern. The concentration phenomenon is discussed heuristically with respect to enteric and lower respiratory infections, malaria, HIV/AIDS, neonatal disorders, tuberculosis, and measles.Long-standing gains in life expectancy and reductions in many of the leading causes of death have been disrupted by the COVID-19 pandemic, the adverse effects of which were spread unevenly among populations. Despite the pandemic, there has been continued progress in combatting several notable causes of death, leading to improved global life expectancy over the study period. Each of the seven GBD super-regions showed an overall improvement from 1990 and 2021, obscuring the negative effect in the years of the pandemic. Additionally, our findings regarding regional variation in causes of death driving increases in life expectancy hold clear policy utility. Analyses of shifting mortality trends reveal that several causes, once widespread globally, are now increasingly concentrated geographically. These changes in mortality concentration, alongside further investigation of changing risks, interventions, and relevant policy, present an important opportunity to deepen our understanding of mortality-reduction strategies. Examining patterns in mortality concentration might reveal areas where successful public health interventions have been implemented. Translating these successes to locations where certain causes of death remain entrenched can inform policies that work to improve life expectancy for people everywhere.Bill & Melinda Gates Foundation.

ABSTRACT Intestinal progenitor cells integrate signals from their niche, and from the gut lumen, to divide and differentiate at a rate that maintains an epithelial barrier to microbial invasion of the host interior. Despite the importance of evolutionarily conserved innate immune defenses to maintain stable host-microbiota relationships, we know little about specific contributions of stem cell immunity to gut homeostasis. We used the Drosophila model to determine the consequences of compromised intestinal stem cell immune activity for epithelial homeostasis. We showed that loss of stem cell immunity greatly impacted growth and renewal in the adult gut. In particular, we noticed that inhibition of stem cell immunity impeded key growth and differentiation events in the progenitor cell compartment leading to a gradual loss of stem cell numbers with age, and an impaired differentiation of mature enteroendocrine cells. Our results highlight the importance of immune signaling in the stem cell population for epithelial function in the adult gut. HIGHLIGHTS The TNFR-like Immune Deficiency (IMD) pathway is active in Drosophila intestinal progenitor cells. Inhibition of IMD in progenitors impairs progenitor cell proliferation. Blocking progenitor cell IMD negatively affects generation of mature epithelial cells.

ABSTRACT Immune signals coordinate the repair of damaged epithelia by intestinal stem cells. However, it is unclear if immune pathways act autonomously within the stem cell to direct the damage response pathway. We consider this an important question, as stem cell dynamics are essential for formation and maintenance of the entire epithelium. We used Drosophila to determine the impact of stem cell-specific loss of NF-κB on tissue regeneration upon chemical injury. We found that loss of NF-κB enhanced cell death, impaired enterocyte renewal and increased mortality. Mechanistically, we showed that the Ras/ERK pathway is essential for NF-κB-dependent maintenance of cell viability and tissue repair. Combined, our data demonstrate that stem cell-intrinsic NF-κB activity is essential for an orderly repair of damaged intestinal epithelia.

Pathogen-mediated damage to the intestinal epithelium activates compensatory growth and differentiation repair programs in progenitor cells. Accelerated progenitor growth replenishes damaged tissue and maintains barrier integrity. Despite the importance of epithelial renewal to intestinal homeostasis, we know little about the effects of pathogen-commensal interactions on progenitor growth. We found that the enteric pathogen Vibrio cholerae, blocks critical growth and differentiation pathways in Drosophila progenitors despite extensive damage to the epithelial tissue. We showed that inhibition of epithelial repair requires interactions of the Vibrio cholerae type six secretion system with a complex community of symbiotic bacteria, and that elimination of the gut microbiome is sufficient to restore homeostatic growth in infected intestines. Together, this work highlights the importance of pathogen-symbiont interactions on intestinal immune responses and outlines a previously undescribed impact of the type six secretion system on pathogenesis.

Abstract The circadian clock is a molecular timekeeper, present from cyanobacteria to mammals, that coordinates internal physiology with the external environment. The clock has a 24-hour period however development proceeds with its own timing, raising the question of how these interact. Using the intestine of Drosophila melanogaster as a model for organ development, we track how and when the circadian clock emerges in specific cell types. We find that the circadian clock begins abruptly in the adult intestine and gradually synchronizes to the environment after intestinal development is complete. This delayed start occurs because individual cells at earlier stages lack the complete circadian clock gene network. As the intestine develops, the circadian clock is first consolidated in intestinal stem cells with changes in ecdysone and Bursicon hormone signalling influencing the transcriptional activity of Clk/cyc to drive the expression of tim , Pdp1, and vri . In the mature intestine, stem cell lineage commitment transiently disrupts clock activity in differentiating progeny, mirroring early developmental clock-less transitions. Our data show that clock function and differentiation are incompatible and provide a paradigm for studying circadian clocks in development and stem cell lineages.

Commensal bacteria regulate the growth and differentiation of intestinal epithelial cells. Deregulated growth compromises the efficacy of critical repair pathways, and promotes tissue dysplasia and tumorigenesis. Despite the importance of bacteria-derived cues for tissue homeostasis, we know little about how intestinal commensals directly influence stem cell division programs. In this study, we examined the effects of common fly symbionts on tissue growth and tumorigenesis in the Drosophila intestine. We identified the cell wall of Lactobacillus brevis as a potent stimulator of Notch-deficient tumor growth. Our work uncovered a complex feed-forward loop between tumor growth and intestinal colonization by L. brevis. Mechanistically, we showed that L. brevis disrupts the expression and apicobasal distribution of integrins in intestinal progenitors, and supports an increase in stem cell numbers characterized by elevated numbers of symmetric stem cell divisions. Collectively, this work highlights host-commensal interactions that influence intestinal growth and stem cell division.

ABSTRACT Vibrio cholerae is an aquatic bacterium that primarily infects the gastrointestinal tract, causing the severe and potentially deadly diarrheal disease, cholera. Despite the impact of Vibrio on global health, our understanding of host mucosal responses to the pathogen at the site of infection remains limited, highlighting a critical knowledge gap that must be addressed to develop more effective prevention and treatment strategies. Using a natural infection model, we combined physiological and single-cell transcriptomic studies to characterize adult zebrafish guts raised under conventional conditions and after a challenge with Vibrio . We discovered that Vibrio causes a mild mucosal immune response characterized by T cell activation and enhanced antigen capture in the epithelium. Additionally, we discovered that Vibrio suppresses host interferon signaling, and that ectopic activation of interferon significantly alters the course of infection. Notably, we also found that the adult zebrafish gut shares many similarities with mammalian counterparts, including the presence of previously undescribed Best4+ cells, tuft cells, and a population of basal cycling cells. These discoveries provide important insights into host-pathogen interactions and emphasize the utility of zebrafish as a natural model of Vibrio infection.

Meteorin-like (metrnl) is a recently identified adipomyokine that has beneficial effects on glucose metabolism. However, its underlying mechanism of action is not completely understood. In this study, we have shown that a level of metrnl increase in vitro under electrical-pulse-stimulation (EPS) and in vivo in exercise mice, suggesting that metrnl is an exercise-induced myokine. In addition, metrnl increases glucose uptake through the calcium-dependent AMPK pathway. Metrnl also increases the phosphorylation of HDAC5, a transcriptional repressor of GLUT4, in an AMPK-dependent manner. Phosphorylated HDAC5 interacts with 14-3-3 proteins and sequesters them in the cytoplasm, resulting in the activation of GLUT4 transcription. The intraperitoneal injection of recombinant metrnl improves glucose tolerance in mice with high fat-induced obesity or type 2 diabetes (db/db), but this is not seen in AMPK muscle-specific null mice (AMPK MKO). In conclusion, we have demonstrated that metrnl induces beneficial effects on glucose metabolism via AMPK and is a promising therapeutic candidate for glucose-related diseases such as type 2 diabetes.