Abstract Transcriptional and functional cellular specialization has been described for insulin-secreting β-cells of the endocrine pancreas. However, it is not clear whether β-cell heterogeneity is stable or reflects dynamic cellular states. We investigated the temporal kinetics of endogenous insulin gene activity using live cell imaging, with complementary experiments employing FACS and single cell RNA sequencing, in β-cells from Ins2 GFP knock-in mice. In vivo staining and FACS analysis of islets from Ins2 GFP mice confirmed that at a given moment, ~25% of β-cells exhibited significantly higher activity at the conserved insulin gene Ins2. Live cell imaging captured Ins2 gene activity dynamics in single β-cells over days. Autocorrelation analysis revealed a subset of cells with oscillating behavior, with mean oscillation periods of 17 hours. Increased glucose concentrations stimulated more cells to oscillate and resulted in higher average Ins2 gene activity per cell. Single cell RNA sequencing showed that Ins2 (GFP) HIGH β-cells were enriched for markers of β-cell maturity. Ins2 (GFP) HIGH β-cells were also significantly less viable at all glucose concentrations and in the context of ER stress. Collectively, our results demonstrate that the heterogeneity of insulin production, observed in mouse and human β-cells, can be accounted for by dynamic states of insulin gene activity. Blurb Previously reported pancreatic β-cell heterogeneity reflects β-cell state transitions.

Population-level variation and mechanisms behind insulin secretion in response to carbohydrate, protein, and fat remain uncharacterized. We defined prototypical insulin secretion responses to three macronutrients in islets from 140 cadaveric donors, including those with type 2 diabetes. The majority of donors' islets exhibited the highest insulin response to glucose, moderate response to amino acid, and minimal response to fatty acid. However, 9% of donors' islets had amino acid responses, and 8% had fatty acid responses that were larger than their glucose-stimulated insulin responses. We leveraged this heterogeneity and used multi-omics to identify molecular correlates of nutrient responsiveness, as well as proteins and mRNAs altered in type 2 diabetes. We also examined nutrient-stimulated insulin release from stem cell-derived islets and observed responsiveness to fat but not carbohydrate or protein-potentially a hallmark of immaturity. Understanding the diversity of insulin responses to carbohydrate, protein, and fat lays the groundwork for personalized nutrition.

Summary The rising pancreatic cancer incidence due to obesity and type 2 diabetes is closely tied to hyperinsulinemia, an independent cancer risk factor. Previous studies demonstrated reducing insulin production suppressed pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) pre-cancerous lesions in Kras -mutant mice. However, the pathophysiological and molecular mechanisms remained unknown and in particular it was unclear whether hyperinsulinemia affected PanIN precursor cells directly or indirectly. Here, we demonstrate that insulin receptors ( Insr ) in Kras G12D -expressing pancreatic acinar cells are dispensable for glucose homeostasis, but necessary for hyperinsulinemia-driven PanIN formation in the context of diet-induced hyperinsulinemia and obesity. Mechanistically, this was attributed to amplified digestive enzyme protein translation, triggering of local inflammation and PanIN metaplasia in vivo . In vitro , insulin dose-dependently increased acinar-to-ductal metaplasia formation in a trypsin– and Insr -dependent manner. Collectively, our data shed light on the mechanisms connecting obesity-driven hyperinsulinemia and pancreatic cancer development.

ABSTRACT Objective Pancreatic β cells play a key role in glucose homeostasis; dysfunction of this critical cell type causes type 2 diabetes (T2D). Emerging evidence points to sex differences in β cells, but few studies have examined male-female differences in β cell stress responses and resilience across multiple contexts, including diabetes. Here, we address the need for high-quality information on sex differences in β cell/islet gene expression and function using both human and rodent samples. Methods We compared β cell gene expression and insulin secretion in donors living with T2D to non-diabetic donors in both males and females. In mice, we generated a well-powered islet RNAseq dataset from 20-week-old male and female siblings with equivalent insulin sensitivity. Because on our unbiased analysis of gene expression pointed to sex differences in endoplasmic reticulum (ER) stress response, we subjected islets isolated from age-matched male and female mice to thapsigargin treatment and monitored protein synthesis, cell death, and β cell insulin production and secretion. Transcriptomic and proteomic analyses were used to characterize sex differences in islet responses to ER stress. Results Our single-cell analysis of human β cells revealed sex-specific changes to gene expression and function in T2D, correlating with more robust insulin secretion in islets isolated from female donors living with T2D compared to male T2D donors. In mice, RNA sequencing revealed differential enrichment of unfolded protein response pathway-associated genes, where female islets showed higher expression of genes linked with protein synthesis, folding, and processing. This differential expression was biologically significant, as female islets were more resilient to ER stress induction with thapsigargin. Specifically, female islets maintained better insulin secretion and showed a distinct transcriptional response under ER stress compared with males. Conclusions Our data demonstrate that physiologically significant sex differences in β cell gene expression exist in both humans and mice, and that female β cells maintain better insulin production and secretion across multiple physiological and pathological contexts.

Pancreatic β-cells are critical for systemic glucose homeostasis, and most of them undergo cell death during the pathogenesis of type 1 diabetes. We previously showed that a Na+ channel inhibitor, carbamazepine, could protect β-cells in vitro and in vivo. Here, we confirmed the effects of carbamazepine and other Na+ channel inhibitors on human islets and focused on the specific role of the Na+ channel gene, Scn9a (Nav1.7), in β-cell function and survival. Because Scn9a can be found in multiple human and mouse islet cell types, we generated a β-cell specific knockout of Scn9a on the non-obese diabetic (NOD) background. We crossed an Scn9aflox/flox allele onto the Ins1Cre knock-in mouse line resulting in the following genotypes: knockout (NOD.Ins1Cre;Scn9aflox/flox), heterozygous (NOD.Ins1Cre;Scn9aflox/wt), and wildtype littermate controls (NOD.Ins1Cre;Scn9awt/wt). We observed near complete ablation of Na+ currents in knockout β-cells, and intermediate Na+ currents in the heterozygotes. Insulin secretion in response to 15 mM glucose, but not lower concentrations, was significantly reduced from NOD.Ins1Cre;Scn9aflox/floxand NOD.Ins1Cre;Scn9awt/wt islets from both male and female mice. These effects of carbamazepine on insulin secretion in vitro were not additive to the effects of Scn9a knockout, suggesting that Scn9a is the main target of carbamazepine in β-cells that is relevant for insulin secretion. Complete Scn9a deletion also protected β-cells from death in vitro, similarly and non-additively to carbamazepine treatment. Finally, we assessed diabetes incidence in Nod.Scn9aflox/flox mice and NOD.Ins1Cre;Scn9awt/wt mice injected with AAV8-Ins1Cre virus and a found significant reduction in diabetes incidence in β-cell specific knockout mice compared with littermate controls. Collectively, our data show the Scn9a plays important roles in β-cell function, but also contributes to β-cell death and type 1 diabetes progression. Scn9a is a novel drug target to preserve β-cells in type 1 diabetes.

Abstract Pancreatic β cells exist in low and high insulin gene activity states that are dynamic on a scale of hours to days. Here, we used live 3D imaging, mass spectrometry proteomics, and targeted perturbations of β cell signaling to comprehensively investigate Ins2 (GFP) HIGH and Ins2 (GFP) LOW β cell states. We identified the two Ins2 gene activity states in intact isolated islets, and cells in the same state were more likely to be nearer to each other. We report the proteomes of pure β cells to a depth of 5555 proteins and show that β cells with high Ins2 gene activity had increased mRNA processing factors, as well as increased translation. We identified activators of cAMP signaling (GLP1, IBMX) as powerful drivers of transitions from Ins2 (GFP) LOW to the Ins2 (GFP) HIGH states. Okadaic acid and cyclosporine A had the opposite effects. This study provides new insight into the proteomic profiles and regulation of β cell states.