Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia is a genetic arrhythmogenic disorder characterized by stress-induced, bidirectional ventricular tachycardia that may degenerate into cardiac arrest and cause sudden death. The electrocardiographic pattern of this ventricular tachycardia closely resembles the arrhythmias associated with calcium overload and the delayed afterdepolarizations observed during digitalis toxicity. We speculated that a genetically determined abnormality of intracellular calcium handling might be the substrate of the disease; therefore, we considered the human cardiac ryanodine receptor gene (hRyR2) a likely candidate for this genetically transmitted arrhythmic disorder.Twelve patients presenting with typical catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia in the absence of structural heart abnormalities were identified. DNA was extracted from peripheral blood lymphocytes, and single-strand conformation polymorphism analysis was performed on polymerase chain reaction-amplified exons of the hRyR2 gene. Four single nucleotide substitutions leading to missense mutations were identified in 4 probands affected by the disease. Genetic analysis of the asymptomatic parents revealed that 3 probands carried de novo mutations. In 1 case, the identical twin of the proband died suddenly after having suffered syncopal episodes. The fourth mutation was identified in the proband, in 4 clinically affected family members, and in none of 3 nonaffected family members in a kindred with 2 sudden deaths that occurred at 16 and 14 years, respectively, in the sisters of the proband.We demonstrated that, in agreement with our hypothesis, hRyR2 is a gene responsible for catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.

Arrhythmogenic right ventricular dysplasia type 2 (ARVD2, OMIM 600996) is an autosomal dominant cardiomyopathy, characterized by partial degeneration of the myocardium of the right ventricle, electrical instability and sudden death. The disease locus was mapped to chromosome 1q42–q43. We report here on the physical mapping of the critical ARVD2 region, exclusion of two candidate genes (actinin 2 and nidogen), elucidation of the genomic structure of the cardiac ryanodine receptor gene (RYR2) and identification of RYR2 mutations in four independent families. In myocardial cells, the RyR2 protein, activated by Ca2+, induces the release of calcium from the sarcoplasmic reticulum into the cytosol. RyR2 is the cardiac counterpart of RyR1, the skeletal muscle ryanodine receptor, involved in malignant hyperthermia (MH) susceptibility and in central core disease (CCD). The RyR2 mutations detected in the present study occurred in two highly conserved regions, strictly corresponding to those where mutations causing MH or CCD are clustered in the RYR1 gene. The detection of RyR2 mutations causing ARVD2, reported in this paper, opens the way to pre-symptomatic detection of carriers of the disease in childhood, thus enabling early monitoring and treatment.

Background —Familial polymorphic ventricular tachycardia is an autosomal-dominant, inherited disease with a relatively early onset and a mortality rate of ≈30% by the age of 30 years. Phenotypically, it is characterized by salvoes of bidirectional and polymorphic ventricular tachycardias in response to vigorous exercise, with no structural evidence of myocardial disease. We previously mapped the causative gene to chromosome 1q42-q43. In the present study, we demonstrate that patients with familial polymorphic ventricular tachycardia have missense mutations in the cardiac sarcoplasmic reticulum calcium release channel (ryanodine receptor type 2 [RyR2]). Methods and Results —In 3 large families studied, 3 different RyR2 mutations (P2328S, Q4201R, V4653F) were detected and shown to fully cosegregate with the characteristic arrhythmic phenotype. These mutations were absent in the nonaffected family members and in 100 healthy controls. In addition to identifying 3 causative mutations, we identified a number of single nucleotide polymorphisms that span the genomic structure of RyR2 and will be useful for candidate-based association studies for other arrhythmic disorders. Conclusions —Our data illustrate that mutations of the RyR2 gene cause at least one variety of inherited polymorphic tachycardia. These findings define a new entity of disorders of myocardial calcium signaling.

ABSTRACT STAT3 and HIF1α are two fundamental transcription factors involved in many merging processes, like angiogenesis, metabolism, and cell differentiation. Notably, under pathological conditions, the two factors have been shown to interact genetically, but both the molecular mechanisms underlying such interactions and their relevance under physiological conditions remain unclear. Here we report that STAT3 is required for the HIF1α-dependent response to hypoxia. In Stat3 knock-out pluripotent embryonic stem cells (ESCs), a large fraction of HIF1α target genes is not induced by hypoxia. Mechanistically, STAT3 does not regulate neither HIF1α expression nor stability, rather, it physically interacts with it in the nucleus. In vivo , we observed that both genetic and chemical inactivation of Stat3 blunted physiological responses to hypoxia, such as angiogenesis, erythropoiesis, and immune cell mobilization. Such defects were accompanied with faulty transcriptional activity of HIF1α. In sum, our data reveal that STAT3 and HIF1α cooperatively mediate the physiological response to hypoxia.

Abstract Approximatively 40% of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) patients exhibit primary resistance to standard therapy. Moreover, relapse is a common event in first-line responders. Overexpression of BCL-2 is a major determinant of resistance to chemotherapy in several B-cell neoplasms, including DLBCL. While venetoclax, a specific BCL-2 inhibitor, has dramatically changed the therapeutic landscape of other B-cell malignancies, only 12% of DLBCL patients exhibit a complete response to venetoclax, with a mean progression-free survival of 1 month. In this scenario, new therapeutic strategies are urgently needed. We tested the possibility to overcome the resistance of DLBCL cells to venetoclax by rewiring their reactive oxygen species (ROS) set point, which is higher in cancer cells compared to their healthy counterparts. We employed a panel of 14 DLBCL cell lines of both germinal center B-cell (GCB) and activated B-cell (ABC) derivation. Cell death, ROS accumulation, and NADPH levels were evaluated upon treatment of DLBCL cells with three inhibitors of NADPH production, the central electron donor required to maintain ROS scavengers in their reduced form. The synergism between venetoclax and inhibitors of NADPH production was assessed through isobologram analysis. RNA-Seq, quantitative real-time PCR (qRT-PCR), and western blot techniques were used to dissect the mechanism of cooperation between venetoclax and inhibition of NADPH production. The Zebrafish model was used for in vivo validation of the therapeutic approach. We observed that inhibiting NADPH production dramatically improves the response to venetoclax by more than 500-fold, while no toxic effects were observed in normal B-cells. By generating isogenic cell lines with differing sensitivity to venetoclax, we demonstrated that the resistance to this drug positively correlates with the expression of the anti-apoptotic protein BCL-xL. Moreover, RNA-seq and protein analyses indicated that the increase of ROS levels engages the integrated stress response (ISR). Pharmacological inhibition and gene silencing of key effectors of the ISR rescued DLBCL cells from cell death induced by our therapeutic strategy. We also confirmed the ROS-dependency of BCL-xL downregulation using both ROS scavengers and by pulsing cells with exogenous hydrogen peroxide. Finally, in vivo studies confirmed the sensitization of DLBCL cells to venetoclax upon the inhibition of NADPH production. Taken together, these results provide the first proof-of-principle evidence for a ROS-based strategy to increase the therapeutic window of venetoclax in DLBCL, suggesting a viable therapeutic avenue to treat refractory patients. Citation Format: Francesco Ciccarese, Vittoria Raimondi, Alberto Corradin, Natascia Tiso, Giovanni Risato, Micol Silic-Benussi, Ilaria Cavallari, Donna Mia D'Agostino, Vincenzo Ciminale. A novel strategy to overcome resistance of diffuse large B-cell lymphoma to venetoclax [abstract]. In: Proceedings of the Fourth AACR International Meeting on Advances in Malignant Lymphoma: Maximizing the Basic-Translational Interface for Clinical Application; 2024 Jun 19-22; Philadelphia, PA. Philadelphia (PA): AACR; Blood Cancer Discov 2024;5(3_Suppl):Abstract nr PO-032.

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Public grant(s) – National budget only. Main funding source(s): Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro [AIRC grant IG-2017-19928], Italian Ministry of University and Research [grant PRIN 20173ZWACS] Introduction Arrhythmogenic cardiomyopathy (AC) is an inherited disorder characterized by progressive loss of the ventricular myocardium causing life-threatening ventricular arrhythmias, syncope and sudden cardiac death in young and athletes. About 40% of AC cases carry one or more mutations in genes encoding for desmosomal proteins, including Desmoplakin (Dsp). Methods We generated the first stable Dsp knock-out (KO) zebrafish line able to model cardiac alterations and cell signalling dysregulation, characteristic of the AC disease. Results Our stable Dsp knock-out (KO) zebrafish line was characterized by cardiac alterations, edema and bradycardia at larval stages. Histological analysis of mutated adult hearts showed reduced contractile structures and abnormal shape of the ventricle, with thinning of the myocardial layer, vessels dilation and presence of adipocytes within the myocardium. Moreover, TEM analysis revealed "pale", disorganized and delocalized desmosomes. Intensive physical training protocol caused a global worsening of the cardiac phenotype, accelerating the progression of the disease. Of note, we detected a decrease of Wnt/β-catenin signalling, recently associated with AC pathogenesis, as well as Hippo/YAP-TAZ and TGF-β pathway dysregulation. Pharmacological treatment of mutated larvae with SB216763, a Wnt/β-catenin agonist, rescued pathway expression and cardiac abnormalities, stabilizing the heart rhythm. Conclusion Our Dsp KO zebrafish line recapitulates many AC features observed in human patients, pointing at zebrafish as a suitable system for in vivo analysis of environmental modulators, such as the physical exercise, and the screening of pathway-targeted drugs, especially related to the Wnt/β-catenin signalling cascade.

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Public grant(s) – National budget only. Main funding source(s): Italian Ministry of University and Research Introduction Arrhythmogenic Cardiomyopathy (AC) is a rare inherited cardiac disorder characterized by fibro-fatty replacement and progressive loss of the ventricular myocardium, causing life-threatening arrhythmias, syncope and sudden cardiac death in young and athletes. About 50% of AC cases carry one or more mutations in genes encoding for desmosomal proteins. However, mutations in non-desmosomal genes have been identified in 1-3% of AC patients, such as Galectin-3 (Gal-3). Purpose For a better understanding of Gal-3 role in AC pathogenesis, we have generated a stable Gal-3 knock-out (KO) zebrafish line, able to reproduce cardiac abnormalities and cell signaling dysregulation characteristic of AC, on which environmental factors and candidate drugs can be tested. Methods The zebrafish Gal-3 mutant line was generated by CRISPR/Cas9 strategy and then phenotypically characterized. Phenotyping included heart activity characterization, by pyHeart4Fish software, and gene expression analysis using Real Time PCR and signaling pathway reporters. Immunofluorescence analysis was performed using an antibody against L-plastin, a leukocyte marker for the detection of inflammatory cells, and Acridine Orange/Ethidium Bromide (AO/EB) staining to check for apoptotic and necrotic events. Transmission Electron Microscopy (TEM) analysis was carried out to detect possible ultrastructural alterations. A pathway-directed pharmacological treatment was applied to try to rescue pathological phenotypes. Results The Gal-3 KO zebrafish line, analysed at larval stage, presented structural abnormalities, pericardial effusion and/or hemopericardium associated with reduced contractility, bradycardia and presence of arrhythmia events. In addition to Wnt/β-catenin signaling dysregulation, as seen in other AC forms, we also observed cell death and inflammation. Specifically, the analysis of the L-plastin inflammatory marker showed remarkable infiltration of inflammatory cells in the cardiac region of Gal-3 mutants, whereas AO/EB staining demonstrated elevated number of apoptotic and necrotic cells. Moreover, TEM analysis revealed "pale", disorganized and delocalized desmosomes in mutant adult hearts. Of note, pharmacological treatment at larval stage, using a Wnt/β-catenin signaling agonist, partially rescued a set of AC cardiac phenotypes (contractility, bradycardia, arrhythmia). Conclusions Overall, the Gal-3 KO zebrafish line confirms in zebrafish the strict connection between Gal-3 mutation and AC-like cardiac alterations. Moreover, cell death and inflammation, known to be involved in the remodelling of the myocardium, were observed. The pharmacological rescue of the Wnt/β-catenin signaling partially recovered a set of cardiac phenotypes, confirming this pathway as a key modulator of AC progression. In conclusion, our results strongly support the usefulness of the Gal-3 zebrafish mutant to clarify Gal-3 involvement in AC, offering future perspectives for AC treatment.

ABSTRACT The STAT3 transcription factor, acting both in the nucleus and mitochondria, maintains embryonic stem cell pluripotency and promotes their proliferation. In this work, using zebrafish, we determined in vivo that mitochondrial STAT3 regulates mtDNA transcription in embryonic and larval stem cell niches and that this activity affects their proliferation rates. As a result, we demonstrated that STAT3 import inside mitochondria requires Y705 phosphorylation by Jak2, while its mitochondrial transcriptional activity, as well as its effect on proliferation, depends on the MAPK target S727. These data were confirmed using mouse embryonic stem cells: Y705 mutated STAT3 cannot enter the mitochondrion while the S727 mutation does not affect mitochondrial import of the protein. Surprisingly, STAT3-dependent increase of mitochondrial transcription seems independent from STAT3 binding to STAT3 responsive elements. Finally, loss of function experiments, with chemical inhibition of JAK/STAT3 pathway or genetic ablation of stat3 gene, demonstrated that STAT3 is also required for cell proliferation in the intestine of zebrafish.