Adult neurons from Caenorhabditis elegans can extrude large membrane-surrounded vesicles, known as exophers, containing protein aggregates and dysfunctional organelles that threaten neuronal homeostasis. Monica Driscoll and colleagues show that in the nematode Caenorhabditis elegans, adult neurons are able to extrude large membrane-surrounded vesicles, dubbed exophers, that may contain protein aggregates and organelles. Inhibiting chaperone expression, autophagy or the proteasome, or compromising mitochondrial quality, results in increased exopher production. Proteotoxically stressed neurons that extrude exophers subsequently function better than similarly stressed neurons that do not. These data suggest that exopher-genesis is a potential cellular 'garbage-removal' response. The toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease1,2. Accordingly, neurons invest considerable cellular resources in chaperones, protein degradation, autophagy and mitophagy to maintain proteostasis and mitochondrial quality3,4. Complicating the challenges of neuroprotection, misfolded human disease proteins and mitochondria can move into neighbouring cells via unknown mechanisms, which may promote pathological spread5,6. Here we show that adult neurons from Caenorhabditis elegans extrude large (approximately 4 μm) membrane-surrounded vesicles called exophers that can contain protein aggregates and organelles. Inhibition of chaperone expression, autophagy or the proteasome, in addition to compromising mitochondrial quality, enhances the production of exophers. Proteotoxically stressed neurons that generate exophers subsequently function better than similarly stressed neurons that did not produce exophers. The extruded exopher transits through surrounding tissue in which some contents appear degraded, but some non-degradable materials can subsequently be found in more remote cells, suggesting secondary release. Our observations suggest that exopher-genesis is a potential response to rid cells of neurotoxic components when proteostasis and organelle function are challenged. We propose that exophers are components of a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, which, when dysfunctional or diminished with age, might actively contribute to pathogenesis in human neurodegenerative disease and brain ageing.

Summary CNS neurons do not regenerate after injury, leading to permanent functional deficits. Although sensory and motor neuron axons do regrow after peripheral nerve injury, functional outcome is limited due to the incomplete and slow regrowth. The lack of human-relevant assays suitable for large-scale drug screens has limited neuro-repair therapy discovery. To address this we developed a phenotypic screening strategy using human induced pluripotent stem cell-derived motor neurons to identify axon-regeneration promoting compounds and targets. The screens involve both re-plating human motor neurons on chondroitin sulfate proteoglycans and measuring regeneration responses to laser axotomy in spot cultures, and from them we identified multiple hits that promote injured axon regrowth. The top hit blebbistatin, a non-muscle myosin II inhibitor, accelerated axon regeneration and functional recovery after sciatic nerve injury in vivo . Human “injury in a dish” assays are suitable, therefore, to screen for therapeutic interventions that can induce or accelerate axon regeneration.

ABSTRACT In the aging brain, many of the alterations underlying cognitive and behavioral decline remain opaque. C. elegans offers a powerful model for aging research, with a simple, well-studied nervous system to further our understanding of the cellular modifications and functional alterations accompanying senescence. We perform multi-neuronal functional imaging across the aged C. elegans nervous system, measuring an age-associated breakdown in system-wide functional organization. At single-cell resolution, we detect shifts in activity dynamics toward higher frequencies. In addition, we measure a specific loss of inhibitory signaling that occurs early in the aging process and alters the systems critical excitatory/inhibitory balance. These effects are recapitulated with mutation of the calcium channel subunit UNC-2/CaV2α,. We find that manipulation of inhibitory GABA signaling can partially ameliorate or accelerate the effects of aging. The effects of aging are also partially mitigated by disruption of the insulin signaling pathway, known to increase longevity, or by a reduction of caspase activation. Data from mammals are consistent with our findings, suggesting a conserved shift in the balance of excitatory/inhibitory signaling with age that leads to breakdown in global neuronal dynamics and functional decline.

Abstract Conventional light sheet fluorescence microscopy (LSFM), or selective plane illumination microscopy (SPIM), enables high resolution 3D imaging over a large volume by using two orthogonally aligned objective lenses to decouple excitation and emission. The recent development of oblique plane microscopy (OPM) simplifies LSFM design with only one single objective lens, by using off-axis excitation and remote focusing. However, most reports on OPM has a limited microscopic field of view (FOV), typically within 1×1 mm 2 . Our goal is to overcome the limitation with a new variant of OPM to achieve mesoscopic FOV. We implemented an optical design of mesoscopic scanning OPM to allow using low numerical aperture (NA) objective lens. The angle of the intermediate image before the remote focusing system was increased by a demagnification under Scheimpflug condition such that the light collecting efficiency in the remote focusing system was significantly improved. We characterized the 3D resolutions and FOV by imaging fluorescence microspheres, and demonstrated the volumetric imaging on intact whole zebrafish larvae, mouse cortex, and multiple Caenorhabditis elegans (C . elegans ). We demonstrate a mesoscopic FOV up to ~6× 5×0.6 mm 3 volumetric imaging, the largest reported FOV by OPM so far. The angle of the intermediate image plane is independent of the magnification. As a result, the system is highly versatile, allowing simple switching between different objective lenses with low (10x, NA 0.3) and median NA (20x, NA 0.5). Detailed microvasculature in zebrafish larvae, mouse cortex, and neurons in C. elegans are clearly visualized in 3D. The proposed mesoscopic scanning OPM allows using low NA objective such that centimeter-level FOV volumetric imaging can be achieved. With the extended FOV, simple sample mounting protocol, and the versatility of changeable FOVs/resolutions, our system will be ready for the varieties of applications requiring in vivo volumetric imaging over large length scales.

Abstract Epithelial wound healing requires the coordination of cells to migrate as a unit over the basement membrane after injury. To understand the process of this coordinated movement, it is critical to study the dynamics of cell-cell communication. We developed a method to characterize the injury-induced sustained Ca 2+ mobilizations that travel between cells for periods of time up to several hours. These events of communication are concentrated along the wound edge and are reduced in cells further away from the wound. Our goal was to delineate the role and contribution of these sustained mobilizations and using MATLAB analyses, we determined the probability of cell-cell communication events in in vitro models and ex vivo organ culture models. We demonstrated that the injury response was complex and represented the activation of a number of receptors. In addition, we found that pannexin channels mediated the cell-cell communication and motility. Furthermore, the sustained Ca 2+ mobilizations are associated with changes in cell morphology and motility during wound healing. The results demonstrate that both purinoreceptors and pannexins regulate the sustained Ca 2+ mobilization necessary for cell-cell communication in wound healing.

Abstract Ultrafast 3D imaging is indispensable for visualizing complex and dynamic biological processes. Conventional scanning-based techniques necessitate an inherent trade-off between acquisition speed and space-bandwidth product (SBP). Emerging single-shot 3D wide-field techniques offer a promising alternative but are bottlenecked by the synchronous readout constraints of conventional CMOS systems, thus restricting data throughput to maintain high SBP at limited frame rates. To address this, we introduce EventLFM, a straightforward and cost-effective system that overcomes these challenges by integrating an event camera with Fourier light field microscopy (LFM), a state-of-the-art single-shot 3D wide-field imaging technique. The event camera operates on a novel asynchronous readout architecture, thereby bypassing the frame rate limitations inherent to conventional CMOS systems. We further develop a simple and robust event-driven LFM reconstruction algorithm that can reliably reconstruct 3D dynamics from the unique spatiotemporal measurements captured by EventLFM. Experimental results demonstrate that EventLFM can robustly reconstruct fast-moving and rapidly blinking 3D fluorescent samples at kHz frame rates. Furthermore, we highlight EventLFM’s capability for imaging of blinking neuronal signals in scattering mouse brain tissues and 3D tracking of GFP-labeled neurons in freely moving C. elegans . We believe that the combined ultrafast speed and large 3D SBP offered by EventLFM may open up new possibilities across many biomedical applications.

Laser microsurgery is a powerful tool for neurobiology used to ablate cells and sever neurites in-vivo. We compare a relatively new laser source to two well-established designs. Rare-earth-doped mode-locked fibre laser that produce high power pulsed radiation recently gained popularity for industrial uses. Such systems are manufactured at high standards of robustness and low maintenance requirements typical of solid-state lasers. We demonstrate that an Ytterbium-doped fibre femtosecond laser is comparable in precision to other femtosecond lasers, but with added reliability. It is more precise and can lesion deeper in tissue than a solid-state nanosecond laser. These advantages are not specific to the model system ablated for our demonstration, namely neurites in the nematode C. elegans, but are applicable to other systems and transparent tissue where a precise submicron resolution dissection is required.

Abstract Cellular metabolism plays an essential role in the regrowth and regeneration of a neuron following physical injury. Yet, our knowledge of the specific metabolic pathways that are beneficial to neuron regeneration remains sparse. Previously, we have shown that modulation of O-linked β-N-acetylglucosamine (O-GlcNAc), a ubiquitous post-translational modification that acts as a cellular nutrient sensor, can significantly enhance in vivo neuron regeneration. Here we define the specific metabolic pathway by which mutation of the O-GlcNAc transferase ( ogt-1) increases regenerative outgrowth. Performing in vivo laser axotomy and measuring subsequent regeneration of individual neurons in C. elegans , we find that the ogt-1 mutation increases regeneration by diverting the metabolic flux of enhanced glycolysis towards one carbon metabolism (OCM) and the downstream transsulfuration metabolic pathway (TSP). These effects are abrogated by genetic and/or pharmacological disruption of OCM or the serine synthesis pathway (SSP) that links OCM to glycolysis. Testing downstream branches of this pathway, we find that enhanced regeneration is dependent only on the vitamin B12 independent shunt pathway. These results are further supported by RNA-sequencing that reveals dramatic transcriptional changes, by the ogt-1 mutation, in the genes involved in glycolysis, OCM, TSP and ATP metabolism. Strikingly, the beneficial effects of the ogt-1 mutation can be recapitulated by simple metabolic supplementation of the OCM metabolite methionine in wild-type animals. Taken together, these data unearth the metabolic pathways involved in the increased regenerative capacity of a damaged neuron in ogt-1 animals and highlight the therapeutic possibilities of OCM and its related pathways in the treatment of neuronal injury. Abstarct Figure. Metabolic pathways involved in the enhanced neuronal regeneration in ogt-1 animals: The green highlighted pathway illustrates the metabolic rewiring in ogt-1 mutant animals supporting enhanced axonal regeneration of injured neurons in vivo .