Abstract FLT3-mutations are diagnosed in 25-30% of patients with acute myeloid leukemia (AML) and are associated with a poor prognosis. AML is associated with the overproduction of reactive oxygen species (ROS), which drives genomic instability through the oxidation of DNA bases, promoting clonal evolution, treatment resistance and poor outcomes. ROS are also important second messengers, triggering cysteine oxidation in redox sensitive signaling proteins, however, the specific pathways influenced by ROS in AML remain enigmatic. Here we have surveyed the posttranslational architecture of primary AML patient samples and assessed oncogenic second messenger signaling. Signaling proteins responsible for growth and proliferation were differentially oxidized and phosphorylated between patient subtypes either harboring recuring mutation in FLT3 compared to patients expressing the wildtype-FLT3 receptor, particularly those mapping to the Src family kinases (SFKs). Patients harboring FLT3-mutations also showed increased oxidative posttranslational modifications in the GTPase Rac activated-NADPH oxidase-2 (NOX2) complex to drive autocratic ROS production. Pharmacological and molecular inhibition of NOX2 was cytotoxic specifically to FLT3-mutant AMLs, and reduced phosphorylation of the critical hematopoietic transcription factor STAT5 and MAPK/ERK to synergistically increase sensitivity to FLT3-inhibitors. NOX2 inhibition also reduced phosphorylation and cysteine oxidation of FLT3 in patient derived xenograft mouse models in vivo , highlighting an important link between oxidative stress and oncogenic signaling. Together, these data raise the promising possibility of targeting NOX2 in combination with FLT3-inhibitors to improve treatment of FLT3-mutant AML. One Sentence Summary FLT3-precision therapies have entered the clinic for AML however, their durability is limited. Here we identify the Rac-NOX2 complex as the major driver of redox second messenger signaling in FLT3-mutant AML. Molecular and pharmacological inhibition of NOX2 decreased FLT3, STAT5 and MEK/ERK signaling to delay leukemia progression, and synergistically combined with FLT3 inhibitors.

ABSTRACT Global high-throughput profiling of oncogenic signaling pathways by phosphoproteomics is increasingly being applied to cancer specimens. Such quantitative unbiased phosphoproteomic profiling of cancer cells identifies oncogenic signaling cascades that drive disease initiation and progression; pathways that are often invisible to genomics sequencing strategies. Therefore, phosphoproteomic profiling has immense potential for informing individualized anti-cancer treatments. However, complicated and extensive sample preparation protocols, coupled with intricate chromatographic separation techniques that are necessary to achieve adequate phosphoproteomic depth, limits the clinical utility of these techniques. Traditionally, phosphoproteomics is performed using isobaric tagged based quantitation coupled with TiO 2 enrichment and offline prefractionation prior to nLC-MS/MS. However, the use of isobaric tags and offline HPLC limits the applicability of phosphoproteomics for the analysis of individual patient samples in real-time. To address these limitations, here we have optimized a new protocol, p hospho- H eavy-l a beled-spiketide FAIM S St e pped-CV D DA (pHASED). pHASED maintained phosphoproteomic coverage yet decreased sample preparation time and complexity by eliminating the variability associated with offline prefractionation. pHASED employed online phosphoproteome deconvolution using high-field asymmetric waveform ion mobility spectrometry (FAIMS) and internal phosphopeptide standards to provide accurate label-free quantitation data. Compared with our traditional tandem mass tag (TMT) phosphoproteomics workflow and optimized using isogenic FLT3-mutant acute myeloid leukemia (AML) cell line models (n=18/workflow), pHASED halved total sample preparation, and running time (TMT=10 days, pHASED=5 days) and doubled the depth of phosphoproteomic coverage in real-time (phosphopeptides = 7,694 pHASED, 3,861 TMT). pHASED coupled with bioinformatic analysis predicted differential activation of the DNA damage and repair ATM signaling pathway in sorafenib-resistant AML cell line models, uncovering a potential therapeutic opportunity that was validated using cytotoxicity assays. Herein, we optimized a rapid, reproducible, and flexible protocol for the characterization of complex cancer phosphoproteomes in real-time, highlighting the potential for phosphoproteomics to aid in the improvement of clinical treatment strategies.

ABSTRACT Alterations in the FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3) gene are the most frequent driver mutations in acute myeloid leukaemia (AML), linked to a high risk of relapse in patients with internal tandem duplications (FLT3-ITD). Tyrosine kinase inhibitors (TKIs) targeting the FLT3 protein are approved for clinical use, yet resistance often emerges. This resistance is mainly seen following the acquisition of additional point mutations in the tyrosine kinase domain (TKD), resulting in a double mutant FLT3-ITD/TKD, which sustains cell signalling and survival despite the presence of FLT3 inhibitors. Here, we developed a FLT3-mutant AML model with adaptive resistance to type II TKIs, sorafenib, and quizartinib by in vitro drug selection. Through global multiomic profiling, we identified upregulation of proteins involved in reactive oxygen species (ROS) production, particularly NADPH-oxidases, driving cellular ’ROS-addiction’, with resistant cells relying on ROS for survival, and genome fidelity preserved by ATM-driven DNA repair. Transcriptomic analysis of adult and paediatric AML (pAML) patients identified high ATM expression as a biomarker for shorter median overall survival in both the de novo and relapsed settings. Inhibition of ATM with clinically relevant therapy WSD-0628 effectively killed TKI- and chemotherapy-resistant AML cells in vitro and significantly extended the survival of mice with sorafenib- and quizartinib-resistant FLT3-ITD AML in vivo . We propose a new treatment strategy to improve survival of patients who develop resistance to sorafenib and quizartinib, as well as relapsed and refractory pAML, exploiting resistance mechanisms to precision therapies and cell-intrinsic features of high-risk cases, highlighting a clinically relevant salvage strategy.

Diffuse midline glioma (DMG), including tumors diagnosed in the brainstem (diffuse intrinsic pontine glioma DIPG), are uniformly fatal brain tumors that lack effective pharmacological treatment. Analysis of pooled CRISPR-Cas9 loss-of-function gene deletion screen datasets, identified PIK3CA and MTOR as targetable molecular dependencies across DIPG patient derived models, highlighting the therapeutic potential of the blood-brain barrier penetrant PI3K/Akt/mTOR inhibitor paxalisib. At the human equivalent maximum tolerated dose, mice treated with paxalisib experienced systemic feedback resulting in increased blood glucose and insulin levels, commensurate with DIPG patients in Phase 1b clinical trials who experienced hyperglycemia/hyperinsulinemia. To exploit genetic dependences, but maintain compliance and benefit, we optimized a paxalisib treatment regimen that employed reduced dosing more frequently, in combination with the anti-hyperglycemic drug, metformin. Combining optimized dosing with metformin restored glucose homeostasis and decreased phosphorylation of the insulin receptor in vivo, a common mechanism of PI3K-inhibitor resistance, extending the survival of DIPG xenograft models. RNA sequencing and phosphoproteomic profiling of DIPG models treated with paxalisib identified increased calcium-activated PKC signaling. Using the brain penetrant PKC inhibitor, enzastaurin in combination with paxalisib, we synergistically extended the survival of orthotopic xenograft models, benefits further promoted by metformin; thus, identifying a clinically relevant DIPG combinatorial approach.