Peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα) regulates the utilization of fat as an energy source during starvation and is the molecular target for the fibrate dyslipidemia drugs. Here, we identify the endocrine hormone fibroblast growth factor 21 (FGF21) as a mediator of the pleiotropic actions of PPARα. FGF21 is induced directly by PPARα in liver in response to fasting and PPARα agonists. FGF21 in turn stimulates lipolysis in white adipose tissue and ketogenesis in liver. FGF21 also reduces physical activity and promotes torpor, a short-term hibernation-like state of regulated hypothermia that conserves energy. These findings demonstrate an unexpected role for the PPARα-FGF21 endocrine signaling pathway in regulating diverse metabolic and behavioral aspects of the adaptive response to starvation.

The crystal structure of a dimeric 2:2:2 FGF:FGFR:heparin ternary complex at 3 Å resolution has been determined. Within each 1:1 FGF:FGFR complex, heparin makes numerous contacts with both FGF and FGFR, thereby augmenting FGF-FGFR binding. Heparin also interacts with FGFR in the adjoining 1:1 FGF:FGFR complex to promote FGFR dimerization. The 6-O-sulfate group of heparin plays a pivotal role in mediating both interactions. The unexpected stoichiometry of heparin binding in the structure led us to propose a revised model for FGFR dimerization. Biochemical data in support of this model are also presented. This model provides a structural basis for FGFR activation by small molecule heparin analogs and may facilitate the design of heparin mimetics capable of modulating FGF signaling.

A new class of protein tyrosine kinase inhibitors was identified that is based on an oxindole core (indolinones). Two compounds from this class inhibited the kinase activity of fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) and showed differential specificity toward other receptor tyrosine kinases. Crystal structures of the tyrosine kinase domain of FGFR1 in complex with the two compounds were determined. The oxindole occupies the site in which the adenine of adenosine triphosphate binds, whereas the moieties that extend from the oxindole contact residues in the hinge region between the two kinase lobes. The more specific inhibitor of FGFR1 induces a conformational change in the nucleotide-binding loop. This structural information will facilitate the design of new inhibitors for use in the treatment of cancer and other diseases in which cell signaling by tyrosine kinases plays a crucial role in disease pathogenesis.

In mammals, fibroblast growth factors (FGFs) are encoded by 22 genes. FGFs bind and activate alternatively spliced forms of four tyrosine kinase FGF receptors (FGFRs 1–4). The spatial and temporal expression patterns of FGFs and FGFRs and the ability of specific ligand-receptor pairs to actively signal are important factors regulating FGF activity in a variety of biological processes. FGF signaling activity is regulated by the binding specificity of ligands and receptors and is modulated by extrinsic cofactors such as heparan sulfate proteoglycans. In previous studies, we have engineered BaF3 cell lines to express the seven principal FGFRs and used these cell lines to determine the receptor binding specificity of FGFs 1–9 by using relative mitogenic activity as the readout. Here we have extended these semiquantitative studies to assess the receptor binding specificity of the remaining FGFs 10–23. This study completes the mitogenesis-based comparison of receptor specificity of the entire FGF family under standard conditions and should help in interpreting and predicting in vivo biological activity. In mammals, fibroblast growth factors (FGFs) are encoded by 22 genes. FGFs bind and activate alternatively spliced forms of four tyrosine kinase FGF receptors (FGFRs 1–4). The spatial and temporal expression patterns of FGFs and FGFRs and the ability of specific ligand-receptor pairs to actively signal are important factors regulating FGF activity in a variety of biological processes. FGF signaling activity is regulated by the binding specificity of ligands and receptors and is modulated by extrinsic cofactors such as heparan sulfate proteoglycans. In previous studies, we have engineered BaF3 cell lines to express the seven principal FGFRs and used these cell lines to determine the receptor binding specificity of FGFs 1–9 by using relative mitogenic activity as the readout. Here we have extended these semiquantitative studies to assess the receptor binding specificity of the remaining FGFs 10–23. This study completes the mitogenesis-based comparison of receptor specificity of the entire FGF family under standard conditions and should help in interpreting and predicting in vivo biological activity. Fibroblast growth factors (FGFs) 2The abbreviations used are: FGF, fibroblast growth factor; FGFR, FGF receptor; HS, heparan sulfate; BHK, baby hamster kidney; FHF, FGF homologous factor. comprise a structurally related family of 22 molecules. FGFs can be grouped into seven subfamilies based on their sequence similarities and functional properties (1Itoh N. Ornitz D.M. Trends Genet. 2004; 20: 563-569Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (794) Google Scholar, 2Ornitz D.M. Itoh N. Genome Biol. 2001; 2 (Reviews 3005)Crossref PubMed Google Scholar, 3Popovici C. Roubin R. Coulier F. Birnbaum D. BioEssays. 2005; 27: 849-857Crossref PubMed Scopus (67) Google Scholar). FGFs bind four high affinity, ligand-dependent FGF receptor tyrosine kinase molecules (FGFR1–4). In the presence of heparan sulfate (HS) glycosaminoglycans, FGFs stably bind FGFRs and lead to the formation of 2:2:2 FGF-FGFR-HS dimers, which enables the cytoplasmic kinase domains to transphosphorylate one another and become activated (4Mohammadi M. Olsen S.K. Ibrahimi O.A. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 107-137Crossref PubMed Scopus (514) Google Scholar). FGFR activation results in the stimulation of various signal transduction cascades that have been implicated in multiple aspects of vertebrate and invertebrate embryonic development, tumor growth, angiogenesis, wound healing, and physiology (2Ornitz D.M. Itoh N. Genome Biol. 2001; 2 (Reviews 3005)Crossref PubMed Google Scholar, 5McKeehan W.L. Wang F. Kan M. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1998; 59: 135-176Crossref PubMed Google Scholar, 6Ornitz D.M. Marie P.J. Genes Dev. 2002; 16: 1446-1465Crossref PubMed Scopus (682) Google Scholar, 7Powers C.J. McLeskey S.W. Wellstein A. Endocr. Relat. Cancer. 2000; 7: 165-197Crossref PubMed Google Scholar). Each FGFR contains an extracellular ligand binding domain, a single transmembrane domain, and an intracellular tyrosine kinase domain. The extracellular ligand binding domain of the FGFR contains two or three Ig-like domains (8Lee P.L. Johnson D.E. Cousens L.S. Fried V.A. Williams L.T. Science. 1989; 245: 57-60Crossref PubMed Google Scholar, 9Johnson D.E. Williams L.T. Adv. Cancer Res. 1993; 60: 1-41Crossref PubMed Google Scholar). Alternative RNA splicing that utilizes one of two unique exons results in two different versions of Ig-like domain III (referred to as domains IIIb and IIIc) in FGFRs 1–3. This alternative splicing is an essential determinant of ligand binding specificity (10Chellaiah A.T. McEwen D.G. Werner S. Xu J. Ornitz D.M. J. Biol. Chem. 1994; 269: 11620-11627Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 11Johnson D.E. Lu J. Chen H. Werner S. Williams L.T. Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 4627-4634Crossref PubMed Google Scholar, 12Ornitz D.M. Xu J. Colvin J.S. McEwen D.G. MacArthur C.A. Coulier F. Gao G. Goldfarb M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 15292-15297Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1355) Google Scholar, 13Duan D.S. Werner S. Williams L.T. J. Biol. Chem. 1992; 267: 16076-16080Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 14Yeh B.K. Igarashi M. Eliseenkova A.V. Plotnikov A.N. Sher I. Ron D. Aaronson S.A. Mohammadi M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 2266-2271Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar). The IIIa (“a”) splice form encodes a secreted extracellular FGF-binding protein with no known signaling capability (13Duan D.S. Werner S. Williams L.T. J. Biol. Chem. 1992; 267: 16076-16080Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). The IIIb (“b”) and IIIc (“c”) splice forms are regulated in a tissue-specific manner, such that the b isoform is restricted to epithelial lineages and the c isoform is preferentially expressed in mesenchymal lineages (15Alarid E.T. Rubin J.S. Young P. Chedid M. Ron D. Aaronson S.A. Cunha G.R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 1074-1078Crossref PubMed Google Scholar, 16Gilbert E. Del Gatto F. Champion-Arnaud P. Gesnel M.C. Breathnach R. Mol. Cell. Biol. 1993; 13: 5461-5468Crossref PubMed Google Scholar, 17Orr-Urtreger A. Bedford M.T. Burakova T. Arman E. Zimmer Y. Yayon A. Givol D. Lonai P. Dev. Biol. 1993; 158: 475-486Crossref PubMed Scopus (460) Google Scholar, 18Yan G. Fukabori Y. McBride G. Nikolaropolous S. McKeehan W.L. Mol. Cell. Biol. 1993; 13: 4513-4522Crossref PubMed Google Scholar). This tissue specificity is particularly important for FGFR2 function. The structural basis by which this major alternative splicing in Ig-like domain III of FGFR2 modulates FGF binding specificity has been elucidated (14Yeh B.K. Igarashi M. Eliseenkova A.V. Plotnikov A.N. Sher I. Ron D. Aaronson S.A. Mohammadi M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 2266-2271Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar). In addition to tissue-specific FGF and FGFR expression, FGFR activation is modulated by heparin, heparan sulfate, or other glycosaminoglycan chains (19Ornitz D.M. Yayon A. Flanagan J.G. Svahn C.M. Levi E. Leder P. Mol. Cell. Biol. 1992; 12: 240-247Crossref PubMed Google Scholar, 20Yayon A. Klagsbrun M. Esko J.D. Leder P. Ornitz D.M. Cell. 1991; 64: 841-848Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 21Rapraeger A.C. Krufka A. Olwin B.B. Science. 1991; 252: 1705-1708Crossref PubMed Google Scholar, 22Penc S.F. Pomahac B. Winkler T. Dorschner R.A. Eriksson E. Herndon M. Gallo R.L. J. Biol. Chem. 1998; 273: 28116-28121Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (173) Google Scholar, 23Taylor K.R. Rudisill J.A. Gallo R.L. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5300-5306Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (89) Google Scholar). Importantly, tissue-specific alterations in glycosaminoglycan structure provide a mechanism to modulate FGF signaling (24Allen B.L. Filla M.S. Rapraeger A.C. J. Cell Biol. 2001; 155: 845-858Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar, 25Allen B.L. Rapraeger A.C. J. Cell Biol. 2003; 163: 637-648Crossref PubMed Scopus (148) Google Scholar, 26Ornitz D.M. BioEssays. 2000; 22: 108-112Crossref PubMed Scopus (586) Google Scholar, 27Perrimon N. Bernfield M. Nature. 2000; 404: 725-728Crossref PubMed Scopus (639) Google Scholar). It has been recently postulated that the HS selectivity in FGF signaling is attained in the context of a 2:2 FGF-FGFR dimer and not by FGF, FGFR, or even 1:1 FGF-FGFR pairs (28Mohammadi M. Olsen S.K. Goetz R. Curr. Opin. Struct. Biol. 2005; PubMed Google Scholar). The identification of FGF-FGFR binding specificities is critical to understanding the biological mechanisms involved in normal development and pathogenesis. Here we extend our previous study (12Ornitz D.M. Xu J. Colvin J.S. McEwen D.G. MacArthur C.A. Coulier F. Gao G. Goldfarb M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 15292-15297Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1355) Google Scholar) to semiquantitatively compare the activity of all signaling members of the FGF family on the major splice forms of all FGFRs. Materials—Human recombinant FGF1, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF16, FGF17, FGF18, and FGF20 were from PeproTech Inc. (Rocky Hill, NJ). Recombinant human FGF12, FGF14, FGF19, FGF21, and FGF23 were expressed in Escherichia coli and purified as previously described (29Yu X. Ibrahimi O.A. Goetz R. Zhang F. Davis S.I. Garringer H.J. Linhardt R.J. Ornitz D.M. Mohammadi M. White K.E. Endocrinology. 2005; 146: 4647-4656Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar, 30Olsen S.K. Garbi M. Zampieri N. Eliseenkova A.V. Ornitz D.M. Goldfarb M. Mohammadi M. J. Biol. Chem. 2003; 278: 34226-34236Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (171) Google Scholar, 31Ibrahimi O.A. Zhang F. Eliseenkova A.V. Itoh N. Linhardt R.J. Mohammadi M. Hum. Mol. Genet. 2004; 13: 2313-2324Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar). The source of FGFR cDNAs, FGFR expression plasmids, and FGFR-expressing BaF3 cell lines were described previously (12Ornitz D.M. Xu J. Colvin J.S. McEwen D.G. MacArthur C.A. Coulier F. Gao G. Goldfarb M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 15292-15297Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1355) Google Scholar). BaF3 Cell Culture and Mitogenic Assay—BaF3 cells expressing specific FGFRs were described previously (12Ornitz D.M. Xu J. Colvin J.S. McEwen D.G. MacArthur C.A. Coulier F. Gao G. Goldfarb M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 15292-15297Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1355) Google Scholar). Cells were maintained in RPMI 1640 medium (Sigma) supplemented with 10% newborn bovine serum (Sigma), 0.5 ng/ml murine-recombinant interleukin-3 (PeproTech Inc.), 2 mm l-glutamine, penicillin-streptomycin, 50 nm β-mercaptoethanol (BaF3 culture medium), and G418 (600 μg/ml). For mitogenic assays, FGFR-expressing BaF3 cells were plated at a density of 30,000 cells/well in a 96-well assay plate in BaF3 assay medium containing varying concentrations of FGF and heparin. FGFs diluted in assay medium were added to each well for a total volume of 200 μl/well. The cells were then incubated for 36–48 h. Mitogenic activity was determined by adding 1 μCi of [3H]thymidine in 50 μl of BaF3 assay medium to each well. The cells were harvested after 4–6 h by filtration through glass fiber paper. The incorporated [3H]thymidine was counted on a Wallac β plate scintillation counter (PerkinElmer Life Sciences). Preparation of FGF22-conditioned Medium—A cDNA encoding the full-length mouse FGF22 protein was isolated from mouse brain mRNA by reverse transcription-PCR (forward primer, 5′-AATTGCTAGCATGCGCAGCCGCCTCTGGCTG-3′; reverse primer, 5′-AGGCCTCGAGAGACGAGACCAAGACTGGCAG-3′) (32Umemori H. Linhoff M.W. Ornitz D.M. Sanes J.R. Cell. 2004; 118: 257-270Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (210) Google Scholar). The PCR product (∼500 bp) was inserted into the NheI-XhoI sites of the APtag5 vector (GenHunter Inc.), replacing both the signal sequence and the alkaline phosphatase sequence. APtag5-mFGF22 or the APtag5 empty vector was transfected into baby hamster kidney (BHK) cells (cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum, 2 mm l-glutamine, and penicillin/streptomycin). The cells were replated at 80–90% confluence into 90-mm dishes the day before transfection and then were transfected with 24 μg of plasmid and 60 μl of Lipofectamine 2000 in 1.5 ml of Opti-MEM (Invitrogen) medium according to the manufacturer's directions. After 48 h, the cells were split 1:20 into Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum, 2 mm l-glutamine, penicillin/streptomycin, and 500 μg/ml Zeocin (Invitrogen). Isolated colonies were picked after 10–14 days and propagated in the same medium. Reverse transcription-PCR (forward primer, 5′-GCTTCTATGTGGCCATGAATCGCA-3′; reverse primer, 5′-AGACCAAGACTGGCAGGAAGTGT-3′) was used to identify stable clonal cell lines expressing high levels of Aptag5-FGF22 (see Fig. 1A). Subconfluent stably transfected cell lines, grown in selection medium, were washed twice with phosphate-buffered saline and allowed to grow in BaF3 assay medium containing 2 μg/ml heparin for 48–72 h. Conditioned medium from control APtag-5 cells and Aptag5-FGF22 cells was collected, centrifuged to remove debris, and used for subsequent BaF3 assays. Data Analysis—FGF1 was used as a positive control to normalize the mitogenic activity of the other FGFs. To reduce sampling error in the comparison of the relative mitogenic activity, the mitogenic activity for each ligand was averaged at two different concentrations (312 and 1250 pm) (see Table 1) and normalized to the activity of FGF1 at these concentrations, or in the case of FGF19, -21, -23 to 5 nm FGF1.TABLE 1Relative mitogenic activity of FGF subfamiliesFGF receptorRelative mitogenic activity ± S.D.FGF-1FGF7 subfamilyFGF8 subfamilyFGF9 subfamilyFGF19 subfamily (×103)FGF7FGF10FGF22FGF8FGF17FGF18FGF9FGF16FGF20FGF19FGF21FGF231c100 ± 514.2 ± 4.112.5 ± 2.510.2 ± 1.757.5 ± 3.222.7 ± 0.34.7 ± 0.412.5 ± 1.44.3 ± 0.328.1 ± 4.0123 ± 5.734 ± 3.023 ± 2.72c100 ± 310.4 ± 4.06.1 ± 1.77.1 ± 1.191.6 ± 8.927.1 ± 9.528.9 ± 4.757.2 ± 5.432.5 ± 3.568.4 ± 2.8238 ± 11.586 ± 4.789 ± 10.53c100 ± 63.3 ± 1.40.8 ± 0.91.0 ± 0.5209 ± 6111 ± 577.7 ± 3.490.4 ± 6.032.4 ± 6.889.5 ± 7.3140 ± 11.123 ± 02.343 ± 5.51b100 ± 48.0 ± 1.539.4 ± 1.340.3 ± 1.65.3 ± 0.46.0 ± 2.26.3 ± 1.17.3 ± 1.06.5 ± 1.17.3 ± 0.912 ± 0.519 ± 3.411 ± 2.42b100 ± 5168 ± 6217 ± 1232 ± 35.9 ± 1.46.3 ± 0.67.8 ± 1.82.9 ± 0.41.8 ± 0.512.3 ± 0.761 ± 6.983 ± 5.466 ± 2.73b100 ± 46.7 ± 1.86.0 ± 0.55.3 ± 0.718.6 ± 6.310.7 ± 2.712.5 ± 2.042.7 ± 2.913 ± 2.644.3 ± 1.520 ± 1.726 ± 1.521 ± 0.84Δ100 ± 417.8 ± 0.511.5 ± 0.512.5 ± 0.9102 ± 0.485.5 ± 1.152.8 ± 1.710.1 ± 0.19.9 ± 0.326.6 ± 0.9410 ± 27.7128 ± 9.6222 ± 11.9 Open table in a new tab Receptor Binding Specificity of FGF Subfamilies—The murine pro-B cell line, BaF3, is an interleukin-3-dependent cell line that is commonly used for the analyses of receptor tyrosine kinase activity. Wild-type BaF3 cells do not express FGFRs, and BaF3 cells transfected with FGFRs proliferate in the absence of interleukin-3 when stimulated with FGF and heparin (19Ornitz D.M. Yayon A. Flanagan J.G. Svahn C.M. Levi E. Leder P. Mol. Cell. Biol. 1992; 12: 240-247Crossref PubMed Google Scholar). Receptor binding specificity for FGFs 1–9 has been previously described (12Ornitz D.M. Xu J. Colvin J.S. McEwen D.G. MacArthur C.A. Coulier F. Gao G. Goldfarb M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 15292-15297Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1355) Google Scholar). To directly compare the activity of FGF subfamilies containing newly described members, all seven FGFR-expressing BaF3 cell lines were assayed with each FGF at concentrations ranging from 20 to 5000 pm (FGFs 1, 7–10, 16–18, and 20) and from 3 to 800 nm (FGFs 19, 21, and 23). FGFs 7, 10, and 22 are more closely related to each other by sequence than to any other FGF and were predicted to have similar activity toward FGFRs. We and others have failed to produce active recombinant FGF22 protein. We therefore developed a cell line that secretes FGF22 into the culture medium (Fig. 1A). Dilutions of conditioned medium were assayed on FGFR2b-BaF3 cells. The concentration of the FGF22-conditioned medium was estimated to be equivalent to an FGF10 concentration of 300–600 pm. Control-conditioned medium showed no activity toward any of the BaF3 cell lines. FGFs 7, 10, and 22 all strongly activated FGFR2b. FGFs 10 and 22 showed weak activity toward FGFR1b, and all three of these FGFs failed to activate any of the other FGFR-expressing cell lines (Fig. 1, B and C; Fig. 5; and Table 1). The FGFs 8, 17, and 18 subfamily members showed similar activities to each other as those previously described (33Xu J.S. Liu Z.H. Ornitz D.M. Development (Camb.). 2000; 127: 1833-1843Crossref PubMed Google Scholar, 34Moon A.M. Guris D.L. Seo J.H. Li L. Hammond J. Talbot A. Imamoto A. Dev. Cell. 2006; 10: 71-80Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (104) Google Scholar). These FGFs specifically activated FGFRs 1c, 2c, and 3c and the two Ig-like domain forms of FGFR4 (4Δ). FGF8 subfamily members showed higher relative activity on FGFR3c cells and less activity toward FGFR1c. No activity was observed on the FGFRb isoform-expressing cell lines (Figs. 2 and 5 and Table 1). The FGFs 9, 16, and 20 subfamily members showed a similar profile to that of FGF9 (12Ornitz D.M. Xu J. Colvin J.S. McEwen D.G. MacArthur C.A. Coulier F. Gao G. Goldfarb M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 15292-15297Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1355) Google Scholar, 35Santos-Ocampo S. Colvin J.S. Chellaiah A.T. Ornitz D.M. J. Biol. Chem. 1996; 271: 1726-1731Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (84) Google Scholar). These FGFs activated FGFRc isoforms and FGFR4 with high activity, and unlike other FGFs that preferentially activate c splice form receptors, these FGFs consistently showed activity toward FGFR3b-expressing cells. FGF20 showed slight activity on FGFR2b cells and no activity on FGFR1b cells. FGFs 9 and 16 showed no activity toward FGFR1b or -2b (Figs. 3 and 5 and Table 1). The FGF19 (mouse FGF15), FGF21, and FGF23 subfamily is unique in that these FGFs can behave as secreted hormones (36Inagaki T. Choi M. Moschetta A. Peng L. Cummins C.L. McDonald J.G. Luo G. Jones S.A. Goodwin B. Richardson J.A. Gerard R.D. Repa J.J. Mangelsdorf D.J. Kliewer S.A. Cell Metab. 2005; 2: 217-225Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1130) Google Scholar, 37Kharitonenkov A. Shiyanova T.L. Koester A. Ford A.M. Micanovic R. Galbreath E.J. Sandusky G.E. Hammond L.J. Moyers J.S. Owens R.A. Gromada J. Brozinick J.T. Hawkins E.D. Wroblewski V.J. Li D.S. Mehrbod F. Jaskunas S.R. Shanafelt A.B. J. Clin. Investig. 2005; 115: 1627-1635Crossref PubMed Scopus (1406) Google Scholar, 38White K.E. Carn G. Lorenz-Depiereux B. Benet-Pages A. Strom T.M. Econs M.J. Kidney Int. 2001; 60: 2079-2086Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (403) Google Scholar, 39Riminucci M. Collins M.T. Fedarko N.S. Cherman N. Corsi A. White K.E. Waguespack S. Gupta A. Hannon T. Econs M.J. Bianco P. Gehron Robey P. J. Clin. Investig. 2003; 112: 683-692Crossref PubMed Scopus (0) Google Scholar, 40Yu X. White K.E. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 221-232Crossref PubMed Scopus (93) Google Scholar, 41Ezzat S. Asa S.L. Horm. Metab. Res. 2005; 37: 355-360Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar). To obtain significant activity of these FGFs on FGFR-expressing BaF3 cells required a protein concentration ranging from 3 to 800 nm and a heparin concentration >10 μg/ml (Fig. 4A). These parameters indicated low relative activity compared with other classic members of the FGF family. However, at these concentrations, FGFs 19, 21, and 23 showed consistent activity toward FGFR1c, 2c, 3c, and FGFR4 but no activity toward FGFR1b, 2b, or 3b (Fig. 4, C and D; Fig. 5; and Table 1). The FGF11 family has no known activity toward any FGFR (30Olsen S.K. Garbi M. Zampieri N. Eliseenkova A.V. Ornitz D.M. Goldfarb M. Mohammadi M. J. Biol. Chem. 2003; 278: 34226-34236Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (171) Google Scholar, 42Goldfarb M. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 215-220Crossref PubMed Scopus (139) Google Scholar, 43Schoorlemmer J. Goldfarb M. Curr. Biol. 2001; 11: 793-797Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (97) Google Scholar). Recombinant FGF12 and FGF14 protein showed no activity on any of the FGFR-expressing BaF3 cell lines, consistent with previous observations (30Olsen S.K. Garbi M. Zampieri N. Eliseenkova A.V. Ornitz D.M. Goldfarb M. Mohammadi M. J. Biol. Chem. 2003; 278: 34226-34236Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (171) Google Scholar) (data not shown). The FGF family is one of the largest growth factor families, consisting of 22 members sharing 13–71% sequence similarity in mammals (2Ornitz D.M. Itoh N. Genome Biol. 2001; 2 (Reviews 3005)Crossref PubMed Google Scholar). FGFs possess a large range of activities in embryonic development and physiological functions in the adult. In the embryo, FGFs often signal across mesenchymal-epithelial boundaries, where they regulate organogenesis and pattern formation (44Boilly B. Vercoutter-Edouart A.S. Hondermarck H. Nurcombe V. Le Bourhis X. Cytokine Growth Factor Rev. 2000; 11: 295-302Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar, 45Ornitz D.M. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 205-213Crossref PubMed Scopus (282) Google Scholar, 46Huang P. Stern M.J. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 151-158Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar, 47Thisse B. Thisse C. Dev. Biol. 2005; 287: 390-402Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar). In the adult, FGFs play important roles in regulating homeostasis, wound healing, and tissue repair (48Finch P.W. Rubin J.S. Adv. Cancer Res. 2004; 91: 69-136Crossref PubMed Scopus (181) Google Scholar). Unregulated expression of FGFs can cause cancer (41Ezzat S. Asa S.L. Horm. Metab. Res. 2005; 37: 355-360Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar, 49Grose R. Dickson C. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 179-186Crossref PubMed Scopus (311) Google Scholar, 50Dailey L. Ambrosetti D. Mansukhani A. Basilico C. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 233-247Crossref PubMed Scopus (498) Google Scholar). The expression patterns of FGF receptors 1, 2, and 3 are distinct but overlap in some tissues. Analysis of the alternative splicing pattern of these receptors demonstrates that the utilization of either the b or c exon is dependent upon cell lineage. The b isoform is preferentially expressed in epithelial tissues, whereas the c isoform is expressed in mesenchymal tissues (17Orr-Urtreger A. Bedford M.T. Burakova T. Arman E. Zimmer Y. Yayon A. Givol D. Lonai P. Dev. Biol. 1993; 158: 475-486Crossref PubMed Scopus (460) Google Scholar, 51Goldstrohm A.C. Greenleaf A.L. Garcia-Blanco M.A. Gene (Amst.). 2001; 277: 31-47Crossref PubMed Scopus (137) Google Scholar, 52Beer H.D. Vindevoghel L. Gait M.J. Revest J.M. Duan D.R. Mason I. Dickson C. Werner S. J. Biol. Chem. 2000; 275: 16091-16097Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (71) Google Scholar, 53Wuechner C. Nordqvist A.C. Winterpacht A. Zabel B. Schalling M. Int. J. Dev. Biol. 1996; 40: 1185-1188PubMed Google Scholar). The activity of several of the FGFs can be divided along these lines. For example, the FGF7 subfamily is expressed in mesenchyme and shows the greatest activity toward FGFR2b. The FGF8 subfamily is expressed in epithelial tissues and activates c splice forms of FGFRs. Binding specificity between FGF and FGFRs is thus critical for the spatial regulation of FGF signaling. The specificity of the FGF7 subfamily, demonstrated in vitro in the BaF3 cell assay (Fig. 5), closely reflects the in vivo function of FGF10, a molecule expressed in mesenchymal tissue that signals to epithelial FGFR2b. Disruption of FGF10 signaling is catastrophic to embryonic development, resulting in severe defects in limb development and in organs requiring branching morphogenesis, such as the pancreas, salivary glands, and lungs (54Miralles F. Czernichow P. Ozaki K. Itoh N. Scharfmann R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 6267-6272Crossref PubMed Scopus (145) Google Scholar, 55Ye F. Duvillie B. Scharfmann R. Diabetologia. 2005; 48: 277-281Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar, 56Steinberg Z. Myers C. Heim V.M. Lathrop C.A. Rebustini I.T. Stewart J.S. Larsen M. Hoffman M.P. Development (Camb.). 2005; 132: 1223-1234Crossref PubMed Scopus (177) Google Scholar, 57Arman E. Haffner-Krausz R. Gorivodsky M. Lonai P. Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A. 1999; 96: 11895-11899Crossref PubMed Scopus (157) Google Scholar, 58Sekine K. Ohuchi H. Fujiwara M. Yamasaki M. Yoshizawa T. Sato T. Yagishita N. Matsui D. Koga Y. Itoh N. Kato S. Nat. Genet. 1999; 21: 138-141Crossref PubMed Scopus (935) Google Scholar, 59Park W.Y. Miranda B. Lebeche D. Hashimoto G. Cardoso W.V. Dev. Biol. 1998; 201: 125-134Crossref PubMed Scopus (252) Google Scholar, 60Bellusci S. Grindley J. Emoto H. Itoh N. Hogan B.L. Development (Camb.). 1997; 124: 4867-4878Crossref PubMed Google Scholar). The interaction between FGF10 and FGFR2b is also required for embryonic palate and cecum development (61Burns R.C. Fairbanks T.J. Sala F. De Langhe S. Mailleux A. Thiery J.P. Dickson C. Itoh N. Warburton D. Anderson K.D. Bellusci S. Dev. Biol. 2004; 265: 61-74Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar, 62Rice R. Spencer-Dene B. Connor E.C. Gritli-Linde A. McMahon A.P. Dickson C. Thesleff I. Rice D.P. J. Clin. Investig. 2004; 113: 1692-1700Crossref PubMed Scopus (0) Google Scholar). Mutations in FGFR2 that alter ligand binding specificity also result in developmental disease. Apert syndrome is a debilitating disease involving craniosynostosis, syndactyly, and mental retardation (63Cohen M.M.J. Cohen M.M.J. MacLean R.E. Craniosynostosis, Diagnosis, Evaluation, and Management. 2nd Ed. Oxford University Press, New York2000Google Scholar, 64Cohen Jr., M.M. Kreiborg S. Am. J. Med. Genet. 1990; 35: 36-45Crossref PubMed Scopus (142) Google Scholar, 65Cohen Jr., M.M. Kreiborg S. Am. J. Med. Genet. 1995; 57: 82-96Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). The molecular etiology of Apert syndrome stems from inappropriate activation of mesenchymal FGFR2c by FGF7 family members (31Ibrahimi O.A. Zhang F. Eliseenkova A.V. Itoh N. Linhardt R.J. Mohammadi M. Hum. Mol. Genet. 2004; 13: 2313-2324Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar, 66Yu K. Ornitz D.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 3641-3643Crossref PubMed Scopus (42) Google Scholar, 67Yu K. Herr A.B. Waksman G. Ornitz D.M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 14536-14541Crossref PubMed Scopus (206) Google Scholar, 68Ibrahimi O.A. Chiu E.S. McCarthy J.G. Mohammadi M. Plast. Reconstr. Surg. 2005; 115: 264-270PubMed Google Scholar, 69Ibrahimi O.A. Eliseenkova A.V. Plotnikov A.N. Yu K. Ornitz D.M. Mohammadi M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001; 98: 7182-7187Crossref PubMed Scopus (155) Google Scholar). The crystal structure of FGF10 in complex with FGFR2b has revealed that specific contacts between residues from the alternatively spliced βC′–βE loop region of FGFR2b and residues in the β4 strand and N terminus of FGF10 account for the FGF10-FGFR2b binding specificity (14Yeh B.K. Igarashi M. Eliseenkova A.V. Plotnikov A.N. Sher I. Ron D. Aaronson S.A. Mohammadi M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 2266-2271Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar). In particular, two highly specific hydrogen bonds involving Asp-76 in the N terminus of FGF10 and Ser-315 in the βC′–βE loop of FGFR2b are essential for FGF10-FGFR2b specificity. The involvement of these hydrogen bonds in conferring specificity between the FGF7 subfamily and FGFR2b is further supported by the fact that Asp-76 is unique to the FGF7 subfamily and Ser-315 is located in the b splice isoform-specific βC′–βE loop (14Yeh B.K. Igarashi M. Eliseenkova A.V. Plotnikov A.N. Sher I. Ron D. Aaronson S.A. Mohammadi M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 2266-2271Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar). FGF8 subfamily members exclusively bind FGFRc splice forms and FGFR4 (Fig. 5). The recent crystal structure of FGF8b in complex with FGFR2c has provided the molecular basis by which FGF8 subfamily members attain their specificity/promiscuity toward c splice isoforms of FGFRs 1–3 and FGFR4 (70Olsen S.K. Li J.Y. Bromleigh C. Eliseenkova A.V. Ibrahimi O.A. Lao Z. Zhang F. Linhardt R.J. Joyner A.L. Mohammadi M. Genes Dev. 2006; 20: 185-198Crossref PubMed Scopus (146) Google Scholar). Importantly, in the case of the FGF8 subfamily, the alternatively spliced βF and βG strands, and not the βC′–βE loop, harbor the primary receptor determinants of FGF8 subfamily binding specificity. This is because the spatial positioning of the N terminus of FGF8 subfamily members, relative to the β-trefoil core, is opposite to that of other FGFs (70Olsen S.K. Li J.Y. Bromleigh C. Eliseenkova A.V. Ibrahimi O.A. Lao Z. Zhang F. Linhardt R.J. Joyner A.L. Mohammadi M. Genes Dev. 2006; 20: 185-198Crossref PubMed Scopus (146) Google Scholar). FGFs 8, 17, and 18 have distinct and overlapping expression patterns in several tissues, such as the developing mid-hindbrain junction (71Maruoka Y. Ohbayashi N. Hoshikawa M. Itoh N. Hogan B.M. Furuta Y. Mech. Dev. 1998; 74: 175-177Crossref PubMed Scopus (161) Google Scholar, 72Xu J. Lawshe A. MacArthur C.A. Ornitz D.M. Mech. Dev. 1999; 83: 165-178Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar, 73Ohbayashi N. Hoshikawa M. Kimura S. Yamasaki M. Fukui S. Itoh N. J. Biol. Chem. 1998; 273: 18161-18164Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (136) Google Scholar). Several of these FGFs are required for central nervous system morphogenesis (33Xu J.S. Liu Z.H. Ornitz D.M. Development (Camb.). 2000; 127: 1833-1843Cross

Phosphate homeostasis is maintained by a counterbalance between efflux from the kidney and influx from intestine and bone. FGF23 is a bone-derived phosphaturic hormone that acts on the kidney to increase phosphate excretion and suppress biosynthesis of vitamin D. FGF23 signals with highest efficacy through several FGF receptors (FGFRs) bound by the transmembrane protein Klotho as a coreceptor. Since most tissues express FGFR, expression of Klotho determines FGF23 target organs. Here we identify the parathyroid as a target organ for FGF23 in rats. We show that the parathyroid gland expressed Klotho and 2 FGFRs. The administration of recombinant FGF23 led to an increase in parathyroid Klotho levels. In addition, FGF23 activated the MAPK pathway in the parathyroid through ERK1/2 phosphorylation and increased early growth response 1 mRNA levels. Using both rats and in vitro rat parathyroid cultures, we show that FGF23 suppressed both parathyroid hormone (PTH) secretion and PTH gene expression. The FGF23-induced decrease in PTH secretion was prevented by a MAPK inhibitor. These data indicate that FGF23 acts directly on the parathyroid through the MAPK pathway to decrease serum PTH. This bone-parathyroid endocrine axis adds a new dimension to the understanding of mineral homeostasis.

The fibroblast growth factor (FGF) 19 subfamily of ligands, FGF19, FGF21, and FGF23, function as hormones that regulate bile acid, fatty acid, glucose, and phosphate metabolism in target organs through activating FGF receptors (FGFR1–4). We demonstrated that Klotho and βKlotho, homologous single-pass transmembrane proteins that bind to FGFRs, are required for metabolic activity of FGF23 and FGF21, respectively. Here we show that, like FGF21, FGF19 also requires βKlotho. Both FGF19 and FGF21 can signal through FGFR1–3 bound by βKlotho and increase glucose uptake in adipocytes expressing FGFR1. Additionally, both FGF19 and FGF21 bind to the βKlotho-FGFR4 complex; however, only FGF19 signals efficiently through FGFR4. Accordingly, FGF19, but not FGF21, activates FGF signaling in hepatocytes that primarily express FGFR4 and reduces transcription of CYP7A1 that encodes the rate-limiting enzyme for bile acid synthesis. We conclude that the expression of βKlotho, in combination with particular FGFR isoforms, determines the tissue-specific metabolic activities of FGF19 and FGF21. The fibroblast growth factor (FGF) 19 subfamily of ligands, FGF19, FGF21, and FGF23, function as hormones that regulate bile acid, fatty acid, glucose, and phosphate metabolism in target organs through activating FGF receptors (FGFR1–4). We demonstrated that Klotho and βKlotho, homologous single-pass transmembrane proteins that bind to FGFRs, are required for metabolic activity of FGF23 and FGF21, respectively. Here we show that, like FGF21, FGF19 also requires βKlotho. Both FGF19 and FGF21 can signal through FGFR1–3 bound by βKlotho and increase glucose uptake in adipocytes expressing FGFR1. Additionally, both FGF19 and FGF21 bind to the βKlotho-FGFR4 complex; however, only FGF19 signals efficiently through FGFR4. Accordingly, FGF19, but not FGF21, activates FGF signaling in hepatocytes that primarily express FGFR4 and reduces transcription of CYP7A1 that encodes the rate-limiting enzyme for bile acid synthesis. We conclude that the expression of βKlotho, in combination with particular FGFR isoforms, determines the tissue-specific metabolic activities of FGF19 and FGF21. The FGF19 2The abbreviations used are:FGFfibroblast growth factorFGFRFGF receptorERKextracellular signal-regulated kinaseTBSTris-buffered salinesiRNAsmall interfering RNARTreverse transcription subfamily of ligands, which consists of FGF15 (the mouse ortholog of human FGF19), FGF19, FGF21, and FGF23, has emerged as a novel group of endocrine factors that regulate diverse metabolic processes in adulthood (1Itoh N. Ornitz D.M. Trends Genet. 2004; 20: 563-569Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (879) Google Scholar). FGF15/19 expression is induced upon feeding in intestinal epithelial cells in response to bile acid released into the intestinal lumen. FGF15/19 then acts on hepatocytes to reduce bile acid synthesis through suppressing transcription of CYP7A1, which encodes the rate-limiting enzyme for bile acid synthesis (2Inagaki T. Choi M. Moschetta A. Peng L. Cummins C.L. McDonald J.G. Luo G. Jones S.A. Goodwin B. Richardson J.A. Gerard R.D. Repa J.J. Mangelsdorf D.J. Kliewer S.A. Cell Metab. 2005; 2: 217-225Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1364) Google Scholar). FGF15/19 also acts on the gall bladder and stimulates its filling with bile. Thus, FGF15/19 functions as an essential component in a postprandial negative feedback loop for bile acid synthesis and release (2Inagaki T. Choi M. Moschetta A. Peng L. Cummins C.L. McDonald J.G. Luo G. Jones S.A. Goodwin B. Richardson J.A. Gerard R.D. Repa J.J. Mangelsdorf D.J. Kliewer S.A. Cell Metab. 2005; 2: 217-225Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1364) Google Scholar, 3Choi M. Moschetta A. Bookout A.L. Peng L. Umetani M. Holmstrom S.R. Suino-Powell K. Xu H.E. Richardson J.A. Gerard R.D. Mangelsdorf D.J. Kliewer S.A. Nat. Med. 2006; 12: 1253-1255Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar). Conversely, FGF21 expression is induced upon fasting in the liver (4Inagaki T. Dutchak P. Zhao G. Ding X. Gautron L. Parameswara V. Li Y. Goetz R. Mohammadi M. Esser V. Elmquist J.K. Gerard R.D. Burgess S.C. Hammer R.E. Mangelsdorf D.J. Kliewer S.A. Cell Metab. 2007; 5: 415-425Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1207) Google Scholar, 5Badman M.K. Pissios P. Kennedy A.R. Koukos G. Flier J.S. Maratos-Flier E. Cell Metab. 2007; 5: 426-437Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1187) Google Scholar). FGF21 secreted from the liver then acts on adipose tissues to induce metabolic adaptation to fasting. Specifically, FGF21 stimulates lipolysis in adipocytes to release fatty acids, which in turn converted to ketones in the liver. FGF21 was originally identified as a hormone that stimulates glucose uptake in adipocytes (6Kharitonenkov A. Shiyanova T.L. Koester A. Ford A.M. Micanovic R. Galbreath E.J. Sandusky G.E. Hammond L.J. Moyers J.S. Owens R.A. Gromada J. Brozinick J.T. Hawkins E.D. Wroblewski V.J. Li D.S. Mehrbod F. Jaskunas S.R. Shanafelt A.B. J. Clin. Investig. 2005; 115: 1627-1635Crossref PubMed Scopus (1648) Google Scholar). However, unlike insulin, FGF21 reduces fat storage because it stimulates lipolysis (4Inagaki T. Dutchak P. Zhao G. Ding X. Gautron L. Parameswara V. Li Y. Goetz R. Mohammadi M. Esser V. Elmquist J.K. Gerard R.D. Burgess S.C. Hammer R.E. Mangelsdorf D.J. Kliewer S.A. Cell Metab. 2007; 5: 415-425Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1207) Google Scholar, 5Badman M.K. Pissios P. Kennedy A.R. Koukos G. Flier J.S. Maratos-Flier E. Cell Metab. 2007; 5: 426-437Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1187) Google Scholar). The FGF23 gene was identified as the gene mutated in patients with autosomal dominant hypophosphatemic rickets (7White K.E. Evans W.E. O'Rlordan J.L.H. Speer M.C. Econs M.J. Lorenz-Deplereux B. Grabowski M. Meitinger T. Storm T.M. Nat. Genet. 2000; 26: 345-348Crossref PubMed Scopus (1297) Google Scholar). Autosomal dominant hypophosphatemic rickets patients carry a missense mutation in the FGF23 gene that confers resistance to proteolytic inactivation of FGF23 protein, resulting in increased blood FGF23 levels. Because of its inhibitory activity on phosphate reabsorption and vitamin D biosynthesis in the kidney, high FGF23 blood levels in autosomal dominant hypophosphatemic rickets patients result in phosphate wasting and defects in bone mineralization (8Quarles L.D. Am. J. Physiol. 2003; 285: E1-E9Crossref PubMed Scopus (287) Google Scholar, 9Schiavi S.C. Kumar R. Kidney Int. 2004; 65: 1-14Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (215) Google Scholar, 10White K.E. Carn G. Lorenz-Depiereux B. Benet-Pages A. Strom T.M. Econs M.J. Kidney Int. 2001; 60: 2079-2086Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (445) Google Scholar, 11Jonsson K.B. Zahradnik R. Larsson T. White K.E. Sugimoto T. Imanishi Y. Yamamoto T. Hampson G. Koshiyama H. Ljunggren O. Oba K. Yang I.M. Miyauchi A. Econs M.J. Lavigne J. Juppner H. N. Engl. J. Med. 2003; 348: 1656-1663Crossref PubMed Scopus (784) Google Scholar). fibroblast growth factor FGF receptor extracellular signal-regulated kinase Tris-buffered saline small interfering RNA reverse transcription The recent crystallographic analysis shows that the topology of the heparin-binding regions of FGF19 and FGF23 diverges completely from that of canonical paracrine-acting FGFs, which reduces the affinity of these ligands for heparin/heparan sulfate (12Goetz R. Beenken A. Ibrahimi O.A. Kalinina J. Olsen S.K. Eliseen-kova A.V. Xu C. Neubert T. Zhang F. Linhardt R.J. Yu X. White K.E. Inagaki T. Kliewer S.A. Yamamoto M. Kurosu H. Ogawa Y. Kuro-o M. Lanske B. Razzaque M.S. Mohammadi M. Mol. Cell. Biol. 2007; 27: 3417-3428Crossref PubMed Scopus (434) Google Scholar, 13Harmer N.J. Pellegrini L. Chirgadze D. Fernandez-Recio J. Blundell T.L. Biochemistry. 2004; 43: 629-640Crossref PubMed Scopus (106) Google Scholar). The weak heparin binding affinity of the FGF19 family members enables them to avoid being captured in extracellular matrices and thus to function as endocrine factors. On the other hand, this weak heparin binding activity reduces the capacity of heparin/heparan sulfate to promotes direct interaction between FGFs and FGFRs (14Mohammadi M. Olsen S.K. Ibrahimi O.A. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 107-137Crossref PubMed Scopus (563) Google Scholar). Indeed, attempts to demonstrate a direct interaction between FGFRs and the FGF19 family proteins in vitro have failed. These observations imply that FGF19 subfamily members require additional cofactors, besides heparin/heparan sulfates, to stably bind to their cognate FGFRs in their target tissues. We and others identified the Klotho protein as a cofactor necessary for FGF23 binding to FGFRs and for efficient activation of FGF signaling (15Kurosu H. Ogawa Y. Miyoshi M. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Baum M.G. Schiavi S. Hu M.C. Moe O.W. Kuro-o M. J. Biol. Chem. 2006; 281: 6120-6123Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1077) Google Scholar, 16Urakawa I. Yamazaki Y. Shimada T. Iijima K. Hasegawa H. Okawa K. Fujita T. Fukumoto S. Yamashita T. Nature. 2006; 444: 770-774Crossref PubMed Scopus (1474) Google Scholar). The klotho gene was originally identified in mice as an aging-suppressor gene that extends life span when overexpressed and accelerates the development of aging-like phenotypes when disrupted (17Kuro-o M. Matsumura Y. Aizawa H. Kawaguchi H. Suga T. Utsugi T. Ohyama Y. Kurabayashi M. Kaname T. Kume E. Iwasaki H. Iida A. Shiraki-Iida T. Nishikawa S. Nagai R. Nabeshima Y. Nature. 1997; 390: 45-51Crossref PubMed Scopus (2841) Google Scholar, 18Kurosu H. Yamamoto M. Clark J.D. Pastor J.V. Nandi A. Gurnani P. McGuinness O.P. Chikuda H. Yamaguchi M. Kawaguchi H. Shimomura I. Takayama Y. Herz J. Kahn C.R. Rosenblatt K.P. Kuro-o M. Science. 2005; 309: 1829-1833Crossref PubMed Scopus (1411) Google Scholar). The klotho gene encodes a single-pass transmembrane protein and is expressed in limited tissues, most notably in the distal convoluted tubules in the kidney (17Kuro-o M. Matsumura Y. Aizawa H. Kawaguchi H. Suga T. Utsugi T. Ohyama Y. Kurabayashi M. Kaname T. Kume E. Iwasaki H. Iida A. Shiraki-Iida T. Nishikawa S. Nagai R. Nabeshima Y. Nature. 1997; 390: 45-51Crossref PubMed Scopus (2841) Google Scholar). The Klotho protein physically interacts with FGFR1c, 3c, and 4 as well as with FGF23 itself (14Mohammadi M. Olsen S.K. Ibrahimi O.A. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 107-137Crossref PubMed Scopus (563) Google Scholar) to stabilize FGF23-FGFR interactions. Forced expression of Klotho conferred responsiveness to FGF23 upon various cell types (15Kurosu H. Ogawa Y. Miyoshi M. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Baum M.G. Schiavi S. Hu M.C. Moe O.W. Kuro-o M. J. Biol. Chem. 2006; 281: 6120-6123Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1077) Google Scholar). The fact that Klotho is essential for efficient activation of FGF signaling by FGF23 may explain why Klotho-deficient mice and FGF23-deficient mice show many overlapping phenotypes, including hyperphosphatemia, hypervitaminosis D, and multiple aging-like symptoms (19Shimada T. Kakitani M. Yamazaki Y. Hasegawa H. Takeuchi Y. Fujita T. Fukumoto S. Tomizuka K. Yamashita T. J. Clin. Investig. 2004; 113: 561-568Crossref PubMed Scopus (1287) Google Scholar, 20Razzaque M.S. Sitara D. Taguchi T. St-Arnaud R. Lanske B. FASEB J. 2006; 20: 720-722Crossref PubMed Scopus (302) Google Scholar). Furthermore, we showed that βKlotho, a Klotho family member protein, functions as a cofactor necessary for FGF21 binding to FGFRs and effective activation of FGF signaling (21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). βKlotho shares 41% amino acid identity with Klotho and is expressed in adipose tissue, liver, and pancreas (22Ito S. Kinoshita S. Shiraishi N. Nakagawa S. Sekine S. Fujimori T. Nabeshima Y. Mech. Dev. 2000; 98: 115-119Crossref PubMed Scopus (263) Google Scholar). βKlotho also physically interacts with multiple FGFRs and significantly increases the affinity of FGF21 for the FGFRs in a manner similar to FGF23, Klotho, and FGFRs (21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). Mice deficient in βKlotho expression have overlapping phenotypes with mice deficient in FGF15 or FGFR4 expression, including increased bile acid synthesis and increased hepatic expression of CYP7A1 and CYP8B1, which encode two key enzymes involved in bile acid synthesis (2Inagaki T. Choi M. Moschetta A. Peng L. Cummins C.L. McDonald J.G. Luo G. Jones S.A. Goodwin B. Richardson J.A. Gerard R.D. Repa J.J. Mangelsdorf D.J. Kliewer S.A. Cell Metab. 2005; 2: 217-225Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1364) Google Scholar, 23Ito S. Fujimori T. Furuya A. Satoh J. Nabeshima Y. Nabeshima Y. J. Clin. Investig. 2005; 115: 2202-2208Crossref PubMed Scopus (200) Google Scholar, 24Yu C. Wang F. Kan M. Jin C. Jones R.B. Weinstein M. Deng C.X. McKeehan W.L. J. Biol. Chem. 2000; 275: 15482-15489Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (312) Google Scholar). Thus, the genetic evidence strongly suggests that FGF15/19, FGFR4, and βKlotho are essential components in the negative regulation of bile acid synthesis. In this report, we provide molecular and cellular evidence indicating that FGF19, like its subfamily member FGF21, requires βKlotho to stably bind to FGFRs and effectively activate FGF signaling. The salient difference between FGF19 and FGF21 activities lies in their distinct receptor binding specificity and the tissue-specific distribution of their cognate receptors. These findings provide new insights into the mechanism by which the FGF19 subfamily of ligands exert distinct metabolic activities in different target organs. Expression Vectors—Expression vectors for βKlotho and FGFRs designed with a V5 epitope tag at their C terminus were generated by polymerase chain reaction of cDNAs as described previously (15Kurosu H. Ogawa Y. Miyoshi M. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Baum M.G. Schiavi S. Hu M.C. Moe O.W. Kuro-o M. J. Biol. Chem. 2006; 281: 6120-6123Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1077) Google Scholar, 21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). Cell Culture and Transfection—Culture of the mouse 3T3-L1 preadipocytes and induction of adipocyte differentiation were described previously (21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). Human embryonic kidney cells (HEK293), rat hepatoma cells (H4IIE), and rat myoblastic cells (L6) (American Type Culture Collection, Manassas, VA) were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum and penicillin/streptomycin. Transfection of expression vectors was performed 36 h prior to the experiments using Lipofectamine (Invitrogen) and FuGENE HD (Roche Applied Science) for HEK293 cells and L6 cells, respectively, according to the manufacturer's protocols. Preparation of FGF19, FGF21, and FGF23—Human recombinant FGF19, FGF21, and FGF23 (R179Q) were expressed in Escherichia coli, refolded in vitro, and purified by affinity, ion exchange, and size exclusion chromatographies as previously described (25Plotnikov A.N. Hubbard S.R. Schlessinger J. Mohammadi M. Cell. 2000; 101: 413-424Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (340) Google Scholar). Egr-1 Promoter Assay—The human early growth response-1 (Egr-1) gene promoter containing ERK-responsive elements (–580 to +30) (16Urakawa I. Yamazaki Y. Shimada T. Iijima K. Hasegawa H. Okawa K. Fujita T. Fukumoto S. Yamashita T. Nature. 2006; 444: 770-774Crossref PubMed Scopus (1474) Google Scholar, 26Bauer I. Hohl M. Al-Sarraj A. Vinson C. Thiel G. Arch Biochem. Biophys. 2005; 438: 36-52Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar) was PCR-amplified from human genomic DNA and subcloned into the pEGFP-N1 vector (Clontech, Mountain View, CA). HEK293 cells were transfected with the reporter plasmid using the FuGENE transfection reagent and selected in medium containing 0.8 mg/ml G418 (Sigma-Aldrich). Clones of stable transformants were isolated and plated on 96-well plates, stimulated with FGF2 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) for 24 h, and lysed with phosphate-buffered saline containing 1% Triton X-100. Fluorescence of the cell lysates was measured using a microplate reader (FLUOstar OPTIMA, BMG Labtechnologies, Inc., Durham, NC) in the fluorescence mode (excitation, 485 nm; emission, 520 nm). Background signal was determined as fluorescence from the well without cells and subtracted to obtain net fluorescence generated from cells. A clone (E2-7) that showed robust response to FGF2 was cotransfected with human βKlotho and puromycin-resistant vectors and selected in the medium containing 0.5 mg/ml G418 and 0.6 μg/ml puromycin (InvivoGen, San Diego, CA). Clones of the double-transfectants were isolated and stimulated with FGF21 and subjected to the enhanced green fluorescent protein assay as described. A clone (Eβ2) that showed robust response to FGF21 was used for testing FGF19 activity. Immunoblot Analysis of FGF Signaling—Cells cultured on multi-well plates were serum-starved overnight and then treated for 10 min with human recombinant FGF19, FGF21, FGF23 (R179Q), or FGF2. The cells were snap-frozen in liquid nitrogen, lysed in a buffer containing inhibitors for phosphatases and proteases, and processed for immunoblot analysis using antibodies against phospho-FRS2α (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), phospho-44/42 mitogen-activated protein kinase (ERK1/2) (Cell Signaling), and ERK1/2 (Cell Signaling) as previously described (15Kurosu H. Ogawa Y. Miyoshi M. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Baum M.G. Schiavi S. Hu M.C. Moe O.W. Kuro-o M. J. Biol. Chem. 2006; 281: 6120-6123Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1077) Google Scholar, 21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). The signal intensity was quantified using an image analysis software (ImageQuant, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Male 129sv mice at 8 weeks of age were administered either FGF19 (1 μgg–1 body weight), FGF21 (0.3 μgg–1 body weight), or vehicle (10 mm HEPES, pH 7.4, 150 mm NaCl) by injection into the inferior vena cava. Liver, perigonadal fat pads, kidneys, and hind limb muscles were excised 15, 17, 19, and 21 min, respectively, after the injection. The tissues were flash-frozen in liquid nitrogen, homogenized in the lysis buffer, and subjected to immunoblotting. All of the animal experiments were approved by the Institutional Animal Care and Research Advisory Committee of The University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas. FGF19 Pull-down—Cell lysates were prepared from HEK293 cells transfected with FGFR alone or cotransfected with FGFR and βKlotho and incubated with anti-V5-agarose beads (Sigma-Aldrich) at 4 °C for 3 h. The beads were washed four times with Tris-buffered saline (TBS) containing 1% Triton X-100 and then incubated with FGF19 (1 μg/ml) at 4 °C for 3 h. There-after, the beads were washed three times with Krebs-Ringer-HEPES buffer (15Kurosu H. Ogawa Y. Miyoshi M. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Baum M.G. Schiavi S. Hu M.C. Moe O.W. Kuro-o M. J. Biol. Chem. 2006; 281: 6120-6123Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1077) Google Scholar) containing 1% Triton X-100 followed by three washes with the same buffer lacking Triton X-100. Bead-bound proteins were eluted with Laemmli sample buffer and subjected to immunoblot analysis using antibodies against V5 tag (Invitrogen), βKlotho (R & D Systems, Minneapolis, MN), or FGF19 (R & D Systems). Knock-down of βKlotho Expression by RNA Interference— 3T3-L1 adipocytes were transfected with siRNA duplexes by electroporation as previously described and then used for immunoblot analysis and for glucose uptake assay (21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). H4IIE cells were transfected by electroporation as well. Briefly, the cells were harvested using trypsin, washed twice with phosphate-buffered saline, suspended in Opti-MEM (Invitrogen) (1 × 107 cells/ml), mixed with 10 nmol/107 cells of siRNA oligonucleotides (see supplemental Table S1), and electroporated with a gene pulser system (0.24 kV and 960 microfarads capacitance) (Bio-Rad). After electroporation, the cells were incubated at 4 °C for 10 min before reseeding onto 6-well plates. Thirty hours after transfection, the cells were serum-starved overnight and used for immunoblot analysis and quantitative RT-PCR. Glucose Uptake Assay—3T3-L1 adipocytes transfected with siRNA were stimulated with FGF19 (1 μg/ml), FGF21 (1 μg/ml), or FGF2 (0.1 μg/ml) in Dulbecco's modified Eagle's medium with 0.1% free fatty acid-free bovine serum albumin (Sigma-Aldrich) for 18 h at 37 °C and subjected to the glucose uptake assay as described previously (21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). Quantitative RT-PCR—Total RNA was isolated using the RNeasy kit (Qiagen). For quantification of CYP7A1 and SHP mRNA, H4IIE cells transfected with siRNA were stimulated with FGF19, FGF21, or vehicle for 18 h before RNA isolation. 4 μg of total RNA was treated with 0.2 unit of DNase I (Promega, Madison, WI) and then reverse-transcribed into first-strand cDNA using the ThemoScript RT-PCR system (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. The specific primers used to quantify gene expression were listed in supplemental Table S2. Quantitative RT-PCR reactions contained 25 ng of cDNA, 150 nm of each primer, and 5 μl of SYBR Green PCR Master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) in a total volume of 10 μl. All of the reactions were performed in triplicate on an Applied Biosystems Prism 7900HT sequence detection system, and relative mRNA levels were calculated by the comparative threshold cycle method using cyclophilin as the internal control. Immunoprecipitation—Liver (200 mg) and white adipose tissue (1000 mg) were homogenized in 1 ml of homogenization buffer (20 mm HEPES, pH 7.4, 100 mm NaCl, and 0.5 mm EDTA) containing protease inhibitors. The homogenates were incubated for 30 min at 4 °C after the addition of Triton X-100 (final, 1.2% w/v) and then centrifuged twice for 12 min at 18,000 × g to remove debris. The supernatant of liver and white adipose tissue were precleared with 40 μl of protein G-Sepharose or protein A-Sepharose (Amersham Biosciences) conjugated with 20 μg of normal goat or rabbit IgG for 3 h at 4 °C, respectively. The precleared lysates of liver and white adipose tissues, respectively, were incubated with 20 μl of protein A-Sepharose conjugated with 20 μgof anti-FGFR4 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) or normal goat IgG and with anti-FGFR1 antibody (Santa Cruz) or normal rabbit IgG for 3 h at 4 °C. The beads were washed four times with TBS containing 1% Triton X-100 and three times with TBS. Bead-bound proteins were eluted with Laemmli sample buffer and subjected to immunoblot analysis using anti-βKlotho, anti-FGFR1 (R & D Systems), and anti-FGFR4 (R & D Systems) antibodies. FGF19 Requires βKlotho to Activate FGF Signaling—Like FGF21 and FGF23, FGF19 failed to robustly activate FGF signaling in HEK293 cells as measured by induction of FRS2α and ERK phosphorylation. Forced expression of Klotho in HEK293 cells caused a selective response to FGF23 but not to FGF19 or FGF21. Conversely, forced expression of βKlotho conferred responsiveness to both FGF21 and FGF19 but not FGF23 (Fig. 1A). Because activation of FGF signaling with FGF23 increases promoter activity and expression of the Egr-1 (early growth response-1) gene in Klotho-expressing cells (16Urakawa I. Yamazaki Y. Shimada T. Iijima K. Hasegawa H. Okawa K. Fujita T. Fukumoto S. Yamashita T. Nature. 2006; 444: 770-774Crossref PubMed Scopus (1474) Google Scholar), we tested whether FGF19 and FGF21 also increase Egr-1 promoter activity in βKlotho-expressing cells. Consistent with the results shown in Fig. 1A, FGF19 and FGF21 activated the Egr-1 promoter only in βKlotho-expressing HEK293 cells in a dose-dependent manner, whereas FGF2 activated it independently of βKlotho expression (Fig. 1B). These observations indicate that FGF19 requires βKlotho to activate FGF signaling. We have shown that βKlotho and Klotho enhance binding affinity of FGF21 and FGF23, respectively, to their cognate FGFRs (15Kurosu H. Ogawa Y. Miyoshi M. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Baum M.G. Schiavi S. Hu M.C. Moe O.W. Kuro-o M. J. Biol. Chem. 2006; 281: 6120-6123Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1077) Google Scholar, 21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). We therefore tested whether βKlotho also enhances binding of FGF19 to its cognate FGFRs. As previously reported, βKlotho binds to FGFR1c and FGFR4 more avidly than does to FGFR2c and FGFR3c (Fig. 1C) and does not interact with “b” isoforms of FGFRs (21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar). In the absence of βKlotho, FGF19 did not bind to FGFR1c and FGFR4 and bound poorly to FGFR2c and 3c. In the presence of βKlotho, binding of FGF21 to FGFR1c and FGFR4 was significantly increased, whereas binding to FGFR2c and FGFR3 was only slightly increased (Fig. 1C). These observations are reminiscent of our previous findings for FGF21 (21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar) and indicate that FGF19 also requires βKlotho for binding to FGFR1c and FGFR4 and for robust activation of FGF signaling. Adipocytes Respond to Both FGF19 and FGF21—Because differentiated 3T3-L1 adipocytes express βKlotho endogenously and respond to FGF21 (21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar), we tested whether FGF19 also activates FGF signaling in these cells. Dose-responsiveness of FRS2α and ERK1/2 phosphorylation induced by FGF19 was comparable with that induced by FGF21 (Fig. 2A). We observed significant attenuation of FGF19- and FGF21-induced FRS2α and ERK1/2 phosphorylation by knocking down βKlotho expression using two independent siRNAs (Fig. 2, B and C), indicating that endogenous βKlotho is required for both FGF19 and FGF21 to activate FGF signaling in adipocytes. Quantification of mRNA levels of mouse FGFR1–4 revealed that 3T3-L1 adipocytes predominantly express FGFR1 (Fig. 2D). These observations indicate that activation of FGF signaling by FGF19 and FGF21 in these cells is mediated through the βKlotho-FGFR1 complex. Because FGF21 increases glucose uptake in adipocytes independently of insulin (6Kharitonenkov A. Shiyanova T.L. Koester A. Ford A.M. Micanovic R. Galbreath E.J. Sandusky G.E. Hammond L.J. Moyers J.S. Owens R.A. Gromada J. Brozinick J.T. Hawkins E.D. Wroblewski V.J. Li D.S. Mehrbod F. Jaskunas S.R. Shanafelt A.B. J. Clin. Investig. 2005; 115: 1627-1635Crossref PubMed Scopus (1648) Google Scholar, 21Ogawa Y. Kurosu H. Yamamoto M. Nandi A. Rosenblatt K.P. Goetz R. Eliseenkova A.V. Mohammadi M. Kuro-o M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2007; 104: 7432-7437Crossref PubMed Scopus (488) Google Scholar), we next tested whether FGF19 exerts similar activity upon adipocytes. Indeed, FGF19 significantly increased glucose uptake within 18 h, which was comparable with that induced by FGF21 (Fig. 2E). These activities of FGF19 and FGF21 are also dependent on βKlotho because they were abolished by knocking down βKlotho expression using two independent siRNAs (Fig. 2E). Hepatocytes Respond to FGF19 but Not FGF21—Because the rat hepatoma cell line H4IIE also expresses βKlotho endogenously, we tested whether FGF19 and FGF21 activate FGF signaling in these cells. The dose-response characteristics of FGF19-induced phosphorylation for FRS2α and ERK1/2 in H4IIE cells were similar to that observed in adipocytes (Fig. 3A). In addition, we noted significant attenuation of FGF19-induced FRS2α and ERK1/2 phosphorylation by knocking down βKlotho expression using two independent siRNAs (Fig. 3, B and C), confirming that endogenous βKlotho is required for FGF19 to activate FGF signaling in hepatocytes as well as in adipocytes. However, in contrast to adipocytes, H4IIE hepatocytes are ∼100-fold less sensitive to FGF21 in terms of induction of FRS2α and ERK1/2 phosphorylation (Fig. 3A). Quantification of mRNA levels of rat FGFR1–4 demonstrated that H4IIE hepatocytes predominantly express FGFR4 (Fig. 3D), indicating that FGF19 can activate FGF signaling through

The liver plays a crucial role in mobilizing energy during nutritional deprivation. During the early stages of fasting, hepatic glycogenolysis is a primary energy source. As fasting progresses and glycogen stores are depleted, hepatic gluconeogenesis and ketogenesis become major energy sources. Here, we show that fibroblast growth factor 21 (FGF21), a hormone that is induced in liver by fasting, induces hepatic expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator protein-1α (PGC-1α), a key transcriptional regulator of energy homeostasis, and causes corresponding increases in fatty acid oxidation, tricarboxylic acid cycle flux, and gluconeogenesis without increasing glycogenolysis. Mice lacking FGF21 fail to fully induce PGC-1α expression in response to a prolonged fast and have impaired gluconeogenesis and ketogenesis. These results reveal an unexpected relationship between FGF21 and PGC-1α and demonstrate an important role for FGF21 in coordinately regulating carbohydrate and fatty acid metabolism during the progression from fasting to starvation.

A novel method has been developed to allow cloning of protein targets for receptors with tyrosine kinase activity. By utilizing the carboxy-terminal tail of EGF receptor (EGFR) as a probe to screen lambda gt11 expression libraries, several EGFR-binding proteins have been cloned; two have been analyzed and contain unique SH2 and SH3 domains. One gene (GRB-1) has been fully sequenced, is expressed in various tissues and cell lines, and has a molecular mass of 85 kd. Interestingly, GRB-1 encodes the human counterpart of the PI3 kinase-associated protein p85. Advantages of this technique include the ease of cloning tyrosine kinase receptor targets present at low levels and the ability to identify proteins that are related in their capacity to bind activated receptors but contain no significant DNA sequence homology. This method, termed CORT (for cloning of receptor targets), offers a general approach for the identification and cloning of various receptor targets.

Although members of the fibroblast growth factor (FGF) family and their receptors have well-established roles in embryogenesis, their contributions to adult physiology remain relatively unexplored. Here, we use real-time quantitative PCR to determine the mRNA expression patterns of all 22 FGFs, the seven principal FGF receptors (FGFRs), and the three members of the Klotho family of coreceptors in 39 different mouse tissues. Unsupervised hierarchical cluster analysis of the mRNA expression data reveals that most FGFs and FGFRs fall into two groups the expression of which is enriched in either the central nervous system or reproductive and gastrointestinal tissues. Interestingly, the FGFs that can act as endocrine hormones, including FGF15/19, FGF21, and FGF23, cluster in a third group that does not include any FGFRs, underscoring their roles in signaling between tissues. We further show that the most recently identified Klotho family member, Lactase-like, is highly and selectively expressed in brown adipose tissue and eye and can function as an additional coreceptor for FGF19. This FGF atlas provides an important resource for guiding future studies to elucidate the physiological functions of FGFs in adult animals.