Late diagnosis contributes to pancreatic cancer (PaCa) dismal prognosis, urging for reliable, early detection. Serum‐exosome protein and/or miRNA markers might be suitable candidates, which we controlled for patients with PaCa. Protein markers were selected according to expression in exosomes of PaCa cell line culture supernatants, but not healthy donors' serum‐exosomes. miRNA was selected according to abundant recovery in microarrays of patients with PaCa, but not healthy donors' serum‐exosomes and exosome‐depleted serum. According to these preselections, serum‐exosomes were tested by flow cytometry for the PaCa‐initiating cell (PaCIC) markers CD44v6, Tspan8, EpCAM, MET and CD104. Serum‐exosomes and exosome‐depleted serum was tested for miR‐1246, miR‐4644, miR‐3976 and miR‐4306 recovery by qRT‐PCR. The majority (95%) of patients with PaCa (131) and patients with nonPa‐malignancies reacted with a panel of anti‐CD44v6, ‐Tspan8, ‐EpCAM and ‐CD104. Serum‐exosomes of healthy donors' and patients with nonmalignant diseases were not reactive. Recovery was tumor grading and staging independent including early stages. The selected miR‐1246, miR‐4644, miR‐3976 and miR‐4306 were significantly upregulated in 83% of PaCa serum‐exosomes, but rarely in control groups. These miRNA were also elevated in exosome‐depleted serum of patients with PaCa, but at a low level. Concomitant evaluation of PaCIC and miRNA serum‐exosome marker panels significantly improved sensitivity (1.00, CI: 0.95–1) with a specificity of 0.80 (CI: 0.67–0.90) for PaCa versus all others groups and of 0.93 (CI: 0.81–0.98) excluding nonPa‐malignancies. Thus, the concomitant evaluation of PaCIC and PaCa‐related miRNA marker panels awaits retrospective analyses of larger cohorts, as it should allow for a highly sensitive, minimally‐invasive PaCa diagnostics.

Inhibiting acute injury–induced senescence mediated by TGFβ signaling in regenerative epithelium improves liver regeneration.

Abstract Objective Hepatocellular carcinoma (HCC) is increasingly associated with non-alcoholic steatohepatitis (NASH). HCC immunotherapy offers great promise; however, recent data suggests NASH-HCC may be less sensitive to conventional immune checkpoint inhibition (ICI). We hypothesised that targeting neutrophils using a CXCR2 small molecule inhibitor may sensitise NASH-HCC to ICI therapy. Design Neutrophil infiltration was characterised in human HCC and mouse models of HCC. Late-stage intervention with anti-PD1 and/or a CXCR2 inhibitor was performed in murine models of NASH-HCC. The tumour immune microenvironment was characterised by imaging mass cytometry, RNA-seq and flow cytometry. Results Neutrophils expressing CXCR2, a receptor crucial to neutrophil recruitment in acute-injury, are highly represented in human NASH-HCC. In models of NASH-HCC lacking response to ICI, the combination of a CXCR2 antagonist with anti-PD1 suppressed tumour burden and extended survival. Combination therapy increased intratumoral XCR1 + dendritic cell activation and CD8 + T cell numbers which are associated with anti-tumoral immunity, this was confirmed by loss of therapeutic effect upon genetic impairment of myeloid cell recruitment, neutralisation of the XCR1-ligand XCL1 or depletion of CD8 + T cells. Therapeutic benefit was accompanied by an unexpected increase in tumour-associated neutrophils (TANs) which switched from a pro-tumor to anti-tumour progenitor-like neutrophil phenotype. Reprogrammed TANs were found in direct contact with CD8 + T cells in clusters that were enriched for the cytotoxic anti-tumoural protease granzyme B. Neutrophil reprogramming was not observed in the circulation indicative of the combination therapy selectively influencing TANs. Conclusion CXCR2-inhibition induces reprogramming of the tumour immune microenvironment that promotes ICI in NASH-HCC. Significance of this study What is already known on this subject? Immune checkpoint inhibition therapy is emerging as a promising new therapy for the treatment of advanced hepatocellular carcinoma (HCC). Only a minority of HCC patients will respond to immune checkpoint inhibition (ICI) therapy and recent data suggest that HCC on the background of NASH may have reduced sensitivity to this treatment strategy. Neutrophils are a typical myeloid component of the liver in NASH and are found either within the HCC tumour microenvironment or in a peritumoural location. Neutrophils have considerable phenotypic plasticity and can exist in both tumour promoting and tumour suppressing states. Neutrophils may have the ability to influence ICI therapy. What are the new findings? CXCR2 + neutrophils are found in human NASH and within the tumour of both human and mouse models of NASH-HCC. The resistance of NASH-HCC to anti-PD1 therapy is overcome by co-treatment with a CXCR2 small molecule inhibitor, with evidence of reduced tumour burden and extended survival. Anti-PD1 and CXCR2 inhibitor combine to selectively reprogramme tumour-associated neutrophils (TANs) from a pro- to an anti-tumour phenotype. Reprogrammed TANs proliferate locally within Granzyme B + immune clusters that contain physically associating CD8 + T cells and antigen presenting cells. Conventional XCR1 + dendritic cells (cDC1s) are found to be elevated in anti-PD1 and CXCR2 inhibitor treated HCCs and together with CD8 + T cells are required for therapeutic benefit. How might it impact on clinical practice in the foreseeable future? TANs can be selectively manipulated to adopt an anti-tumour phenotype which unlocks their potential for cancer therapy. The ability of CXCR2 antagonism to combine with ICI therapy to bring about enhanced therapeutic benefit in NASH-HCC (and potentially in HCC of other aetiologies) warrents clinical investigation.

Abstract/Introduction Understanding how the liver regenerates is a key biological question. Hepatocytes are the principle regenerative population in the liver. Recently, numerous lineage tracing studies (which apply genetic tagging to a restricted population and track its descendants over time) have reported conflicting results using a variety of hepatocyte based reporting systems in mice 1,2 . The first significant lineage tracing from a distinct subpopulation of hepatocytes in homeostasis reported hyper-proliferation of self-renewing pericentral hepatocytes with their subsequent expansion across the liver lobule 3 . This study used a CreERT2 construct knocked into the endogenous Axin2 locus; here termed Axin2CreERT2. Subsequent studies, using either a different pericentral marker (Lgr5 4 ) or a different AxinCreERT2 transgene 5 , did not show lineage tracing. Here we aim to reconcile these discrepancies by re-evaluating lineage tracing in the Axin2CreERT2 knock-in model and explore the physiological consequences of this mutant allele. We were unable to find evidence of expansion of an Axin2CreERT2 labelled population and show that this population, whilst zonated, is spread throughout the lobule rather than being zonally restricted. Finally, we report that this allele results in profound perturbation of the Wnt pathway and physiology in the mouse.

Abstract A Wnt microenvironment sustained by the hepatic central vein is essential for the segregation of liver functions into zones. Current liver culture systems lack localized Wnt cues and as a consequence fail to maintain the hepatocyte functional heterogeneity that is observed in the intact organ. In this study, organoid models and 2D-culture systems were used to identify cellular sources and Wnt presentation methods that could support the future development of zonated liver in vitro systems. Using soluble ligands, we show that primary hepatocyte (PH)-derived organoids but not bile duct (BD)-derived organoids may be used to recapitulate the resting liver. We provide evidence that differentiation of PH-organoids in the presence of Wnt9b and Rspo3 induce pericentral maturation. Finally, we show that immobilization of Rspo3 onto beads in combination with soluble Wnt9b may be a valid strategy to recreate the central vein Wnt microenvironment in vitro .

Summary While it is recognized that the Wnt/ß-catenin pathway orchestrates hepatocyte proliferation in both homeostasis and injury, little is known about the importance of β-catenin in biliary epithelial cell (BEC) plasticity. In this study, the dynamics of activation of the canonical Wnt pathway were investigated during BEC-to-hepatocyte conversion using as a model methionine/choline deficient (MCD)-injured livers where hepatocyte proliferation was compromised by the overexpression of p21. In this model, activation of β-catenin was found an event associated with BEC reprogramming. Using ductal organoids to model BECs transitioning into hepatocytes, we found that activation of the Wnt/ß-catenin pathway in these cells promoted partial escape from a biliary fate and triggered the acquisition of progenitor cell features. Our data furthermore support that BECs are source of Wnt ligands and that Rspo proteins potentially act as the limiting factor controlling the activation of β-catenin activation and BEC reprogramming during severe liver damage.

Abstract Increased protein synthesis enables proliferation of established tumors. However, how mRNA translation contributes to early tumorigenesis remains unclear. Following oncogene activation, hepatocytes enter a non-proliferative/senescent-like phase characterised by deposition of extracellular matrix (ECM) niches which then promote subsequent progression to proliferating hepatocellular carcinoma (HCC). We demonstrate that removal of eIF4A2, a negative regulator of mRNA translation, upregulates synthesis of membrane/secretory proteins. This leads to a compensatory increase of integrin degradation which, in turn, compromises generation of ECM-rich tumour initiation niches and progression to proliferating HCC. Conversely, pharmacological inhibition of mRNA translation following eIF4A2 deletion restores ECM deposition and reinstates HCC progression. Our results highlight how the way in which cells respond to dysregulated mRNA translation in early tumorigenesis influences cancer outcomes. One-Sentence Summary Enhancing rates of secretory protein synthesis during early oncogenesis retards cancer initiation by inhibiting ECM deposition.

Abstract During chronic liver disease, hepatocytes may undergo proliferative arrest, leading to the activation, expansion and differentiation of hepatic progenitor cells (HPCs). Here we observe that expression of A Disintegrin And Metalloprotease (ADAM) 10 is increased in human and murine chronic liver disease correlating with HPC expansion. We report that proteolytic processing of ADAM10 by ADAM9 and generation of an ADAM10 intracellular domain that translocates to the nucleus, rather than ADAM10 enzymatic activity is essential for the regulation of HPC gene expression and differentiation. Genetic loss of ADAM10 in vitro and in vivo enhances stemness gene expression, increases the accumulation of undifferentiated HPCs and promotes the formation of liver fibrosis. Taken together, we demonstrate that a non-catalytic function of ADAM10 is an essential regulator of HPC fate and HPC-driven regeneration. Our data ascribe a non-proteolytic function to ADAM proteases which may be a general concept in adult tissue stem cells.