A study in atherosclerosis-prone (apolipoprotein E-deficient) mice on a high cholesterol diet shows that small cholesterol crystals appear in the earliest stages of atherogenesis, and that these crystals can activate the NLRP3 inflammasome in phagocytes. This suggests that therapeutic strategies that reduce cholesterol crystal deposition or block the inflammasome pathway may have anti-atherosclerotic activity. During atherosclerosis, crystals of cholesterol accumulate in atherosclerotic plaques. But are they a consequence or a cause of the inflammation associated with the disease? Here it is shown that small cholesterol crystals appear early in the development of atherosclerosis, and that they act as an endogenous danger signal, causing inflammation by activating the NLRP3 inflammasome pathway. Cholesterol crystals thus seem to be an early cause, rather than a late consequence, of inflammation. The inflammatory nature of atherosclerosis is well established but the agent(s) that incite inflammation in the artery wall remain largely unknown. Germ-free animals are susceptible to atherosclerosis, suggesting that endogenous substances initiate the inflammation1. Mature atherosclerotic lesions contain macroscopic deposits of cholesterol crystals in the necrotic core, but their appearance late in atherogenesis had been thought to disqualify them as primary inflammatory stimuli. However, using a new microscopic technique, we revealed that minute cholesterol crystals are present in early diet-induced atherosclerotic lesions and that their appearance in mice coincides with the first appearance of inflammatory cells. Other crystalline substances can induce inflammation by stimulating the caspase-1-activating NLRP3 (NALP3 or cryopyrin) inflammasome2,3, which results in cleavage and secretion of interleukin (IL)-1 family cytokines. Here we show that cholesterol crystals activate the NLRP3 inflammasome in phagocytes in vitro in a process that involves phagolysosomal damage. Similarly, when injected intraperitoneally, cholesterol crystals induce acute inflammation, which is impaired in mice deficient in components of the NLRP3 inflammasome, cathepsin B, cathepsin L or IL-1 molecules. Moreover, when mice deficient in low-density lipoprotein receptor (LDLR) were bone-marrow transplanted with NLRP3-deficient, ASC (also known as PYCARD)-deficient or IL-1α/β-deficient bone marrow and fed on a high-cholesterol diet, they had markedly decreased early atherosclerosis and inflammasome-dependent IL-18 levels. Minimally modified LDL can lead to cholesterol crystallization concomitant with NLRP3 inflammasome priming and activation in macrophages. Although there is the possibility that oxidized LDL activates the NLRP3 inflammasome in vivo, our results demonstrate that crystalline cholesterol acts as an endogenous danger signal and its deposition in arteries or elsewhere is an early cause rather than a late consequence of inflammation. These findings provide new insights into the pathogenesis of atherosclerosis and indicate new potential molecular targets for the therapy of this disease.

Pancreatic islets in type 2 diabetes show characteristic deposition of the amyloid polypeptide IAPP. O'Neill and colleagues show that IAPP induces IL-1β production via the NLRP3 inflammasome, which leads to beta-cell destruction. Interleukin 1β (IL-1β) is an important inflammatory mediator of type 2 diabetes. Here we show that oligomers of islet amyloid polypeptide (IAPP), a protein that forms amyloid deposits in the pancreas during type 2 diabetes, triggered the NLRP3 inflammasome and generated mature IL-1β. One therapy for type 2 diabetes, glyburide, suppressed IAPP-mediated IL-1β production in vitro. Processing of IL-1β initiated by IAPP first required priming, a process that involved glucose metabolism and was facilitated by minimally oxidized low-density lipoprotein. Finally, mice transgenic for human IAPP had more IL-1β in pancreatic islets, which localized together with amyloid and macrophages. Our findings identify previously unknown mechanisms in the pathogenesis of type 2 diabetes and treatment of pathology caused by IAPP.

The inflammasome is a complex of proteins involved in the activation of the innate immune system, an evolutionarily ancient antimicrobial defence found in most multicelled animals. When activated the inflammasome sets in motion a cascade of events that leads to the production of active molecules including interleukins. Three papers in this issue report the identification of endogenous danger signals and bacterial components that activate inflammasomes containing cryopyrin (also known as NALP3). Mariathasan et al. show that cryopyrin activates the inflammasome in response to bacterial toxins and to ATP. Kanneganti et al. show that cryopyrin is activated by bacterial RNA and by the immune response modifiers R837 and R848. And Martinon et al. show that gout-associated uric acid crystals have a similar effect. In sum these results show that cryopyrin has a vital role in host antibacterial defences and may act as a sensor of cellular stress. In addition, this work provides insight into the mechanisms of autoinflammatory disorders in which abnormalities in the innate immune system have been implicated. Missense mutations in the CIAS1 gene cause three autoinflammatory disorders: familial cold autoinflammatory syndrome, Muckle–Wells syndrome and neonatal-onset multiple-system inflammatory disease1. Cryopyrin (also called Nalp3), the product of CIAS1, is a member of the NOD-LRR protein family that has been linked to the activation of intracellular host defence signalling pathways2,3. Cryopyrin forms a multi-protein complex termed ‘the inflammasome’, which contains the apoptosis-associated speck-like protein (ASC) and caspase-1, and promotes caspase-1 activation and processing of pro-interleukin (IL)-1β (ref. 4). Here we show the effect of cryopyrin deficiency on inflammasome function and immune responses. Cryopyrin and ASC are essential for caspase-1 activation and IL-1β and IL-18 production in response to bacterial RNA and the imidazoquinoline compounds R837 and R848. In contrast, secretion of tumour-necrosis factor-α and IL-6, as well as activation of NF-κB and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) were unaffected by cryopyrin deficiency. Furthermore, we show that Toll-like receptors and cryopyrin control the secretion of IL-1β and IL-18 through different intracellular pathways. These results reveal a critical role for cryopyrin in host defence through bacterial RNA-mediated activation of caspase-1, and provide insights regarding the pathogenesis of autoinflammatory syndromes.

Viral infection induces the production of interleukin (IL)-1β and IL-18 in macrophages through the activation of caspase-1, but the mechanism by which host cells sense viruses to induce caspase-1 activation is unknown. In this report, we have identified a signaling pathway leading to caspase-1 activation that is induced by double-stranded RNA (dsRNA) and viral infection that is mediated by Cryopyrin/Nalp3. Stimulation of macrophages with dsRNA, viral RNA, or its analog poly(I:C) induced the secretion of IL-1β and IL-18 in a cryopyrin-dependent manner. Consistently, caspase-1 activation triggered by poly(I:C), dsRNA, and viral RNA was abrogated in macrophages lacking cryopyrin or the adaptor ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-activating and recruitment domain) but proceeded normally in macrophages deficient in Toll-like receptor 3 or 7. We have also shown that infection with Sendai and influenza viruses activates the cryopyrin inflammasome. Finally, cryopyrin was required for IL-1β production in response to poly(I:C) in vivo. These results identify a mechanism mediated by cryopyrin and ASC that links dsRNA and viral infection to caspase-1 activation resulting in IL-1β and IL-18 production. Viral infection induces the production of interleukin (IL)-1β and IL-18 in macrophages through the activation of caspase-1, but the mechanism by which host cells sense viruses to induce caspase-1 activation is unknown. In this report, we have identified a signaling pathway leading to caspase-1 activation that is induced by double-stranded RNA (dsRNA) and viral infection that is mediated by Cryopyrin/Nalp3. Stimulation of macrophages with dsRNA, viral RNA, or its analog poly(I:C) induced the secretion of IL-1β and IL-18 in a cryopyrin-dependent manner. Consistently, caspase-1 activation triggered by poly(I:C), dsRNA, and viral RNA was abrogated in macrophages lacking cryopyrin or the adaptor ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-activating and recruitment domain) but proceeded normally in macrophages deficient in Toll-like receptor 3 or 7. We have also shown that infection with Sendai and influenza viruses activates the cryopyrin inflammasome. Finally, cryopyrin was required for IL-1β production in response to poly(I:C) in vivo. These results identify a mechanism mediated by cryopyrin and ASC that links dsRNA and viral infection to caspase-1 activation resulting in IL-1β and IL-18 production. Innate immunity is the initial line of host defense against microbial pathogens, including viral infection. The early recognition of viruses by the host initiates signaling pathways leading to the induction of anti-viral responses, including the secretion of type I interferons (IFNs) 5The abbreviations used are: IFN, interferon; NLR, NOD-like receptor; TLR, Toll-like receptor; NF, nuclear factor; TNF, tumor necrosis factor; ssRNA, single-stranded RNA; dsRNA, double-stranded RNA; IL, interleukin; IKK, IkB kinase; FHV, flock house virus; ERK, extracellular signal-regulated kinase; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; WT, wild-type; MAPK, mitogen-activated protein kinase. α and β and pro-inflammatory cytokines (1Takeda K. Akira S. Int. Immunol. 2005; 17: 1-14Crossref PubMed Scopus (2715) Google Scholar, 3Kawai T. Akira S. Nat. Immunol. 2006; 7: 131-137Crossref PubMed Scopus (1434) Google Scholar). Recognition of pathogens including viruses by the host immune system relies on the detection of conserved molecular structures that are shared by large pathogens (pathogen-associated molecular patterns or PAMPs). In the case of viruses, genomic DNA and single-stranded RNA (ssRNA) or double-stranded RNA (dsRNA) produced during viral replication are sensed by host cells to induce anti-viral responses (3Kawai T. Akira S. Nat. Immunol. 2006; 7: 131-137Crossref PubMed Scopus (1434) Google Scholar). Viral DNA, ssRNA, and dsRNA are recognized by a subfamily of Toll-like receptors (TLRs 3, 7, 8, and 9) in endosomes after the endocytosis of viral particles in mammalian cells (4Alexopoulou L. Holt A.C. Medzhitov R. Flavell R.A. Nature. 2001; 413: 732-738Crossref PubMed Scopus (4936) Google Scholar, 9Krug A. French A.R. Barchet W. Fischer J.A. Dzionek A. Pingel J.T. Orihuela M.M. Akira S. Yokoyama W.M. Colonna M. Immunity. 2004; 21: 107-119Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (605) Google Scholar). Upon activation, these TLRs recruit the adaptor proteins MyD88 or TRIF (Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor-inducing interferon-β) to activate the IkB kinase (IKK) complex and the IKK-related kinases TBK1 and IKKϵ (1Takeda K. Akira S. Int. Immunol. 2005; 17: 1-14Crossref PubMed Scopus (2715) Google Scholar, 10Akira S. Takeda K. Nat. Rev. Immunol. 2004; 4: 499-511Crossref PubMed Scopus (6702) Google Scholar). Viral dsRNA is recognized by TLR3 and the two cytosolic RNA helicases, the retinoic acid inducible gene I (RIG-I), and MDA5 (which induces activation of IKK and TBK1/IKKϵ) (4Alexopoulou L. Holt A.C. Medzhitov R. Flavell R.A. Nature. 2001; 413: 732-738Crossref PubMed Scopus (4936) Google Scholar, 11Kato H. Sato S. Yoneyama M. Yamamoto M. Uematsu S. Matsui K. Tsujimura T. Takeda K. Fujita T. Takeuchi O. Akira S. Immunity. 2005; 23: 19-28Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1110) Google Scholar, 12Yoneyama M. Kikuchi M. Natsukawa T. Shinobu N. Imaizumi T. Miyagishi M. Taira K. Akira S. Fujita T. Nat. Immunol. 2004; 5: 730-737Crossref PubMed Scopus (3122) Google Scholar). Activation of the IKK complex that includes the catalytic subunits IKKα and IKKβ as well as the regulatory subunit IKKγ/NEMO mediates NFκB activation, whereas that of TBK1 and IKKϵ induces phosphorylation and activation of IRF3 or IRF7 (10Akira S. Takeda K. Nat. Rev. Immunol. 2004; 4: 499-511Crossref PubMed Scopus (6702) Google Scholar, 13Ishitani T. Takaesu G. Ninomiya-Tsuji J. Shibuya H. Gaynor R.B. Matsumoto K. EMBO J. 2003; 22: 6277-6288Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar, 14Jin G. Klika A. Callahan M. Faga B. Danzig J. Jiang Z. Li X. Stark G.R. Harrington J. Sherf B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 2028-2033Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). The nuclear translocation of NFκB and IRF3/IRF7 mediates the transcriptional activation of interferon and cytokine genes that limit viral replication and promote adaptive immune responses (15McWhirter S.M. Fitzgerald K.A. Rosains J. Rowe D.C. Golenbock D.T. Maniatis T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 233-238Crossref PubMed Scopus (451) Google Scholar, 17Sharma S. tenOever B.R. Grandvaux N. Zhou G.P. Lin R. Hiscott J. Science. 2003; 300: 1148-1151Crossref PubMed Scopus (1366) Google Scholar). Signaling pathways other than NFκB or IFN that are activated upon viral recognition and mediate anti-viral responses are poorly understood. Previous studies have shown that infection of macrophages with certain viruses including influenza A and Sendai virus induce interleukin (IL)-1β and IL-18 secretion (18Pirhonen J. Sareneva T. Kurimoto M. Julkunen I. Matikainen S. J. Immunol. 1999; 162: 7322-7329PubMed Google Scholar, 19Julkunen I. Sareneva T. Pirhonen J. Ronni T. Melen K. Matikainen S. Cytokine Growth Factor Rev. 2001; 12: 171-180Crossref PubMed Scopus (287) Google Scholar), but the mechanism by which host cells sense viruses to induce caspase-1 activation is unknown. Both IL-1β and IL-18 are synthesized as inactive cytoplasmic precursors that are processed into biologically active mature forms in response to various pro-inflammatory stimuli, including viruses by caspase-1, a cysteine protease (18Pirhonen J. Sareneva T. Kurimoto M. Julkunen I. Matikainen S. J. Immunol. 1999; 162: 7322-7329PubMed Google Scholar, 20Martinon F. Burns K. Tschopp J. Mol. Cell. 2002; 10: 417-426Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4233) Google Scholar, 21Pirhonen J. Sareneva T. Julkunen I. Matikainen S. Eur. J. Immunol. 2001; 31: 726-733Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar). Caspase-1 is synthesized as an inactive zymogen that becomes activated by cleavage at aspartic residues to generate an enzymatically active heterodimer composed of a 10- and 20-kDa chain (20Martinon F. Burns K. Tschopp J. Mol. Cell. 2002; 10: 417-426Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4233) Google Scholar). Recent studies have implicated members of the NOD-like receptor (NLR) family of proteins (also called NOD-LRR (nucleotide binding oligomerization domain-(leucine-rich repeat) or CATERPILLER) in the regulation of caspase-1 activation in response to microbial pathogens (22Inohara N. Chamaillard M. McDonald C. Núñez G. Annu. Rev. Biochem. 2005; 74: 355-383Crossref PubMed Scopus (812) Google Scholar, 23Ting J.P. Davis B.K. Annu. Rev. Immunol. 2005; 23: 387-414Crossref PubMed Scopus (299) Google Scholar). The NLR family is composed of 23 cytosolic proteins, including Nod1, Nod2, Cryopyrin/Nalp3, and Ipaf. The structure of NLRs include an amino-terminal effector binding region that consists of protein-protein interaction domains, such as caspase-recruitment domains or pyrin (a central nucleotide binding oligomerization domain that acts to oligomerize these proteins) and carboxyl-terminal leucine-rich repeats that are required to detect specific PAMPs (22Inohara N. Chamaillard M. McDonald C. Núñez G. Annu. Rev. Biochem. 2005; 74: 355-383Crossref PubMed Scopus (812) Google Scholar). Cryopyrin forms an endogenous multiprotein complex containing ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-activating and recruitment domain) and caspase-1 dubbed “the inflammasome,” which promotes caspase activation and processing of pro-IL-1β (24Martinon F. Agostini L. Meylan E. Tschopp J. Curr. Biol. 2004; 14: 1929-1934Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (465) Google Scholar, 25Agostini L. Martinon F. Burns K. McDermott M.F. Hawkins P.N. Tschopp J. Immunity. 2004; 20: 319-325Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1389) Google Scholar). Notably, missense mutations in the CIAS1 gene that encodes Cryopyrin cause three autoinflammatory disorders characterized by deregulated production of IL-1β (26Stojanov S. Kastner D.L. Curr. Opin. Rheumatol. 2005; 17: 586-599Crossref PubMed Scopus (308) Google Scholar). Cryopyrin senses bacterial RNA, synthetic anti-viral purine analogs, and monosodium urate or calcium pyrophosphate dehydrate crystals (27Kanneganti T.D. Ozoren N. Body-Malapel M. Amer A. Park J.H. Franchi L. Whitfield J. Barchet W. Colonna M. Vandenabeele P. Bertin J. Coyle A. Grant E.P. Akira S. Núñez G. Nature. 2006; 440: 233-236Crossref PubMed Scopus (902) Google Scholar, 28Martinon F. Petrilli V. Mayor A. Tardivel A. Tschopp J. Nature. 2006; 440: 237-241Crossref PubMed Scopus (3790) Google Scholar). In addition, other results indicate that Cryopyrin regulates caspase-1 activation in response to factors that induce intracellular K+ efflux, such as certain toxins and high concentrations of extracellular ATP (29Mariathasan S. Weiss D.S. Newton K. McBride J. O'Rourke K. Roose-Girma M. Lee W.P. Weinrauch Y. Monack D.M. Dixit V.M. Nature. 2006; 440: 228-232Crossref PubMed Scopus (2348) Google Scholar, 30Sutterwala F.S. Ogura Y. Szczepanik M. Lara-Tejero M. Lichtenberger G.S. Grant E.P. Bertin J. Coyle A.J. Galan J.E. Askenase P.W. Flavell R.A. Immunity. 2006; 24: 317-327Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (784) Google Scholar). The genome of poxviruses encode Pyrin-containing proteins that interact with components of the inflammasome and inhibit caspase-1 activation and the processing of IL-1β and IL-18 induced by diverse stimuli (31Johnston J.B. Barrett J.W. Nazarian S.H. Goodwin M. Ricuttio D. Wang G. McFadden G. Immunity. 2005; 23: 587-598Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (182) Google Scholar). These results suggest that certain viruses target components of caspase-1 activation pathways to circumvent host anti-viral responses. However, the signaling pathways that link viral infection to caspase-1 activation and IL-1β/IL-18 are unknown. Here we show that viral dsRNA and its analog poly(I:C) as well as viral infection activate caspase-1 through cryopyrin, resulting in the production of active IL-1β and IL-18. The signaling pathway stimulated by dsRNA and cryopyrin was independent of TLR3 or TLR7. These results identify a novel TLR-independent signaling pathway that is mediated by cryopyrin and ASC and leads to the secretion of pro-inflammatory cytokines in response to viral infection. Mice—Cryopyrin, ASC, and TLR7 knock-out mice have been described previously (27Kanneganti T.D. Ozoren N. Body-Malapel M. Amer A. Park J.H. Franchi L. Whitfield J. Barchet W. Colonna M. Vandenabeele P. Bertin J. Coyle A. Grant E.P. Akira S. Núñez G. Nature. 2006; 440: 233-236Crossref PubMed Scopus (902) Google Scholar, 32Ozoren N. Masumoto J. Franchi L. Kanneganti T.D. Body-Malapel M. Erturk I. Jagirdar R. Zhu L. Inohara N. Bertin J. Coyle A. Grant E.P. Núñez G. J. Immunol. 2006; 176: 4337-4342Crossref PubMed Scopus (156) Google Scholar, 33Hemmi H. Kaisho T. Takeuchi O. Sato S. Sanjo H. Hoshino K. Horiuchi T. Tomizawa H. Takeda K. Akira S. Nat. Immunol. 2002; 3: 196-200Crossref PubMed Scopus (2072) Google Scholar). TLR3 knock-out mice (4Alexopoulou L. Holt A.C. Medzhitov R. Flavell R.A. Nature. 2001; 413: 732-738Crossref PubMed Scopus (4936) Google Scholar) were obtained from The Jackson Laboratory. Macrophages—Bone marrow was prepared from the leg bones of 5–20-week-old mice. The legs were dissected and the bone marrow flushed out. Bone marrow cells were cultured with Iscove's modified Dulbecco's medium supplemented with 30% L929 supernatant containing macrophage-stimulating factor, glutamine, sodium pyruvate, 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Invitrogen), 50 μg/ml penicillin, and 50 μg/ml streptomycin at 37 °C in 5% CO2 for 5 days (bone marrow differentiation medium). Bone marrow macrophages were then harvested with rubber scrapers and seeded. Peritoneal macrophages were elicited to the peritoneum of mice and isolated 4 days after the injection of 4% thioglycolate broth. After 1 day, non-adherent cells were removed, and the remaining macrophages were incubated in Iscove's modified Dulbecco's medium supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, 50 μg/ml penicillin, and 50 μg/ml streptomycin. In Vitro RNA Transcription, Viruses, and Viral RNA—The dsRNA for hsp90 and LacZ were made according to the protocol described in Ref. 34Kampmueller K.M. Miller D.J. J. Virol. 2005; 79: 6827-6837Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar. To prepare flock house virus (FHV) dsRNA, the plasmids pFHV2(0,0) and p2VHF(2,0) (35Ball L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 12443-12447Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar) were used to generate viral (+) and (–) ssRNAs, respectively. Plasmids were linearized with RsrII, in vitro transcripts were synthesized using T7 polymerase and an Ambion Megascript kit per the manufacturer's instructions, and RNA was purified by phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation and quantitated by spectrophotometry. Equal amounts of (+) and (–) RNA transcripts were mixed in RNase-free water, heated to 75 °C for 30 min, and allowed to cool gradually at room temperature to form dsRNA. Viral RNA integrity and formation of dsRNA were assessed by non-denaturing agarose gel electrophoresis. Murine Sendai virus (strain Cantell) was purchased from the American Type Culture Collection and influenza A/Puerto Rico/8/34 virus (H1N1) was a gift from James R. Becker, Jr. (University of Michigan). Rotavirus (strain SA11–4F) dsRNA was isolated by phenol-chloroform extraction from virus grown in monkey kidney (MA014) cells and purified by CsCl centrifugation (36Patton J.T. Wentz M. Xiaobo J. Ramig R.F. J. Virol. 1996; 70: 3961-3971Crossref PubMed Google Scholar). Microbial Ligands and Antibodies—Pam2CGDPKHPKSF (FSL-1), Pam3CSK4, poly(I:C), and CpG oligonucleotide (5′-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3′) were purchased from Invivogen. poly(A), (C), (G), and (U) ssRNA and poly(I)·poly(C) dsRNA were from Sigma. Purified total RNA from Escherichia coli was purchased from Ambion. Bacillus anthracis protective antigen and lethal factor were obtained from List Biologicals Laboratories and were used at 1 μg/ml concentration. Aliquots of RNA samples were incubated with RNases (Ambion) as suggested by the manufacturer. Rabbit anti-mouse caspase-1 was a generous gift of P. Vandenabeele (Ghent University, Ghent, Belgium). The antibodies for mouse IκBα, phospho-IκBα, p38, phospho-p38, ERK, and phospho-ERK were from Cell Signaling Technologies. Immunoblotting—Cells were washed twice with phosphate-buffered saline and scraped in lysis buffer solution (150 mm NaCl, 10 mm Tris, pH 7.4, 5 mm EDTA, 1 mm EGTA, 0.1% Nonidet P-40) supplemented with 1× protease inhibitor mixture (Roche Diagnostics). For analysis of caspase-1 activation, macrophages were cultured with stimuli for 1–3 h and then with medium containing 5 mm ATP (Sigma) for 30 min. Extracts were prepared from cells and culture supernatants by adding lysis buffer containing 1% Nonidet P-40 supplemented with complete protease inhibitor mixture (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) and 2 mm dithiothreitol. Samples were clarified, denatured with SDS buffer, and boiled for 5 min, separated by SDS-PAGE, and transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were immunoblotted with primary antibodies and proteins detected with appropriate secondary anti-rabbit antibody conjugated to horseradish peroxidase followed by enhanced chemiluminescence. Measurements of Cytokines— Macrophages were stimulated with various microbial and synthetic ligands for 24 h and the supernatants were analyzed for IL-1β, IL-18, TNFα, and IL-6 secretion. The ligand concentrations used were FLS-1 and Pam3CSK4 (at 1μg/ml) and poly(I:C) (at 2.5 μg/ml). Mouse cytokines were measured in culture supernatants by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits (R&D Systems, Minneapolis, MN). Cryopyrin Is Required for IL-1β and IL-18 Secretion in Response to the dsRNA Analog Poly(I:C)—To assess a role for cryopyrin in immune responses induced by viruses, macrophages from wild-type (WT) and cryopyrin-deficient mice were stimulated with polyinosinic-polycytidylic acid (poly(I:C), a synthetic dsRNA analog that mimics viral infection and a synthetic diacylated lipopeptide (FSL-1, TLR2 agonist) or E. coli RNA as controls. Incubation of wild-type macrophages with poly(I:C) induced IL-1β, but this response was abolished in cryopyrin-null macrophages (Fig. 1, A and B). Consistent with previous results, production of IL-1β in response to E. coli RNA (but not FSL-1) was deficient in cryopyrinnull macrophages (Fig. 1A). Additionally, cryopyrin was required for IL-18 induced by poly(I:C), but dispensable for IFNα production (Fig. 1, C and D). These results indicate that cryopyrin is specifically required for IL-1β/IL-18 secretion induced by poly(I:C). Cryopyrin-dependent IL-1β Secretion by Poly(I:C) Is Independent of NFκB and MAPK Activation—Stimulation of macrophages with poly(I:C) induces the secretion of several pro-inflammatory cytokines (4Alexopoulou L. Holt A.C. Medzhitov R. Flavell R.A. Nature. 2001; 413: 732-738Crossref PubMed Scopus (4936) Google Scholar). We found that cryopyrin was dispensable for the production of TNFα and IL-6 induced by poly(I:C) (Fig. 2, A and B). In contrast, production of TNFα and IL-6 required TLR3 (Fig. 2, C and D), as previously reported (4Alexopoulou L. Holt A.C. Medzhitov R. Flavell R.A. Nature. 2001; 413: 732-738Crossref PubMed Scopus (4936) Google Scholar). The induction of IL-1β secretion is thought to involve the up-regulation of pro-IL-1β through transcriptional mechanisms via NFκB and then a second stimulus that leads to the activation of caspase-1, processing of pro-IL-1β, and release of mature IL-1β (37Perregaux D.G. McNiff P. Laliberte R. Conklyn M. Gabel C.A. J. Immunol. 2000; 165: 4615-4623Crossref PubMed Scopus (212) Google Scholar, 38Dinarello C.A. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1998; 856: 1-11Crossref PubMed Scopus (422) Google Scholar). Stimulation with poly(I:C) induced comparable levels of NFκB, ERK, and p38 activation in WT and cryopyrin–/– macrophages (Fig. 2E). By contrast, the activation of NFκB and MAPKs was abolished in TLR3-deficient macrophages (Fig. 2F). These results demonstrate that cryopyrin-mediated IL-1β secretion induced by poly(I:C) is independent of NFκB and MAPK as well as TLR3. Cryopyrin (but Not Nod2/TLR3/TLR7) Is Essential for Activation of Caspase-1 in Response to Poly(I:C)— Proteolytic activation of procaspase-1 is a critical step in the induction of IL-1β secretion (39Cerretti D.P. Kozlosky C.J. Mosley B. Nelson N. Van Ness K. Greenstreet T.A. March C.J. Kronheim S.R. Druck T. Cannizzaro L.A. Huebner K. Black R.A. Science. 1992; 256: 97-100Crossref PubMed Scopus (999) Google Scholar, 40Thornberry N.A. Bull H.G. Calaycay J.R. Chapman K.T. Howard A.D. Kostura M.J. Miller D.K. Molineaux S.M. Weidner J.R. Aunins J. Elliston K.O. Ayala J.M. Casano F.J. Chin J. Ding G.J.F. Egger L.A. Gaffney E.P. Limjuco G. Palyha O.C. Raju S.M. Rolando A.M. Salley J.P. Yamin T.T. Lee T.D. Shively J.E. MacCross M. Mumford R.A. Schmidt J.A. Tocci M.J. Nature. 1992; 356: 768-774Crossref PubMed Scopus (2210) Google Scholar). Importantly, processing of pro-caspase-1 was induced rapidly (by 1 h) and in a dose-dependent manner after stimulation of WT macrophages with poly(I:C), as determined by the detection of the mature 20-kDa subunit of caspase-1 (Fig. 3, A and B). Such activation of caspase-1 was abrogated in macrophages lacking cryopyrin (Fig. 3, A and B) or ASC (Fig. 3C), an adaptor that links cryopyrin to caspase-1 (25Agostini L. Martinon F. Burns K. McDermott M.F. Hawkins P.N. Tschopp J. Immunity. 2004; 20: 319-325Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1389) Google Scholar, 41Dowds T.A. Masumoto J. Zhu L. Inohara N. Núñez G. J. Biol. Chem. 2004; 279: 21924-21928Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (197) Google Scholar). In contrast, activation of caspase-1 induced by poly(I:C) was unimpaired in Nod2- and TLR3- or TLR7-deficient macrophages (Fig. 3, D–F). These results demonstrate that cryopyrin is essential for caspase-1 processing in response to poly(I:C). Furthermore, TLR3 is required for NFκB and MAPK activation but dispensable for caspase-1 activation. Cryopyrin-dependent IL-1β and IL-18 Secretion and Caspase-1 Activation by Poly(I:C) Requires dsRNA Structure—We next tested several ssRNA and dsDNA compounds to determine the structural requirements for IL-1β and IL-18 secretion and caspase-1 activation induced by poly(I:C). Importantly, the synthetic ssRNA analogs (polycytidylic acid (poly(C), polyuridylic acid (poly(U), or polyinosinic (poly(I)) neither induce IL-1β and IL-18 secretion (Fig. 4, A and B) nor caspase-1 activation (Fig. 4C). Moreover, the dsDNA analogs polydeoxyinosinic-deoxycytidylic acid (poly(dI: dC)) and polydeoxyinosinic-deoxcytidylic acid (poly(dG:dC)) did not have any effect on IL-1β secretion or caspase-1 activation (Fig. 4, A–C). To further verify these results, we treated poly(I:C) with a panel of RNases that cleave ssRNA, dsRNA, or both. Digestion of poly(I:C) with RNase A and RNase T1 that are specific for ssRNA had little or no effect on caspase-1 activation induced by poly(I:C) (Fig. 4D). In contrast, treatment of poly(I:C) with RNase V1 that cleaves dsRNA or with benzonase that digests both ssRNA and dsRNA abolished its ability to induce processing of caspase-1 (Fig. 4D). Together, these results indicate that the dsRNA structure of poly(I:C) is essential for cryopyrin-dependent induction of IL-1β secretion and caspase-1 activation in macrophages. Viral and Non-viral dsRNA Produced in Vitro Induce Cryopyrin-dependent Caspase-1 Activation— Poly(I:C) does not represent all viral and non-viral dsRNA. To assess whether in vitro transcribed dsRNAs induce caspase-1 activation, we produced ∼700 bp dsRNA fragments from the 5′ coding region of the lacZ and Drosophila Hsp83 genes using the in vitro transcription system (34Kampmueller K.M. Miller D.J. J. Virol. 2005; 79: 6827-6837Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 35Ball L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 12443-12447Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar). In addition, complementary plus sense (+) and minus sense (–) ssRNAs of FHV were produced by in vitro transcription and annealed to form viral dsRNA. Stimulation of macrophages with FHV dsRNA as well as non-viral dsRNAs induced caspase-1 activation as effectively as the poly(I:C) that was used as a control (Fig. 5A). As expected, neither the (+) ssRNA nor the (–) ssRNA used in preparing FHV dsRNA was able to induce processing of caspase-1 (Fig. 5B). As observed with poly(I:C), digestion of FHV dsRNA with RNases that digest dsRNA (but not ssRNA) abolished their ability to induce caspase-1 activation (Fig. 5, C and D). Additionally, treatment of dsRNAs with E. coli RNase III, an endoribonuclease that cleaves dsRNA into 10–18-bp dsRNA fragments, had no effect on their ability to induce caspase-1 activation (Fig. 5E). Cryopyrin/ASC-dependent Activation of Caspase-1 by Naturally Produced Viral dsRNA—We next tested the ability of genomic dsRNA purified from rotavirus grown in monkey kidney cells to induce caspase-1 activation. Incubation of macrophages with naturally produced rotavirus dsRNA induced caspase-1 activation in WT but not cryopyrin-deficient cells (Fig. 6A). Similarly, cryopyrin was required for the activation of caspase-1 induced by viral dsRNA purified from plant cells infected with brome mosaic virus as well as by in vitro produced brome mosaic viral dsRNA. (Fig. 6B). In contrast, caspase-1 activation triggered by the lethal toxin of B. anthracis, consisting of the protective antigen and lethal factor that depends on Nalp1b (42Boyden E.D. Dietrich W.F. Nat. Genet. 2006; 38: 240-244Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar), proceeded normally in the absence of cryopyrin (Fig. 6A). Consistent with the results obtained with poly(I:C), activation of caspase-1 induced by rotavirus dsRNA required ASC but not TLR3 or TLR7 (Fig. 6, D–F). Furthermore, treatment of naturally produced rotavirus and dsRNA with RNase V1 (but not RNase III) abolished their ability to induce caspase-1 activation (Fig. 6G). Infection of Macrophages with Sendai and Influenza Viruses Induce Cryopyrin-dependent Caspase-1 Activation—We next tested the ability of Sendai and influenza A virus, two viruses known to stimulate IL-1β secretion in human macrophages (18Pirhonen J. Sareneva T. Kurimoto M. Julkunen I. Matikainen S. J. Immunol. 1999; 162: 7322-7329PubMed Google Scholar, 21Pirhonen J. Sareneva T. Julkunen I. Matikainen S. Eur. J. Immunol. 2001; 31: 726-733Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar), to induce caspase-1 activation in WT and cryopyrin-deficient macrophages. Macrophages were infected with Sendai or influenza A virus at a low multiplicity of infection, and cell extracts were examined for pro-caspase-1 processing by immunoblotting. The analysis revealed that both viruses induced caspase-1 activation in WT but not cryopyrin-deficient macrophages (Fig. 7A). As it was observed with viral dsRNA, activation of caspase-1 triggered by viral infection was independent of TLR3 and TLR7 (Fig. 7B). Cryopyrin Is Required for Production of IL-1β and IL-18 after Administration of Poly(I:C) in Vivo—We next examined whether cryopyrin plays a role in the production of pro-inflammatory cytokines in the animal. Intraperitoneal administration of poly(I:C) induced the production of IL-1β, IL-18, TNFα, and IL-6 in the serum of wild-type mice. Similarly, the bacterial lipopeptide Pam3CSK4 (TLR2 agonist) also induced the production of IL-1β, TNFα, and IL-6 in the serum of wild-type mice. (Fig. 8). In contrast, the serum levels of IL-1β, IL-18, and to lesser extent IL-6 were greatly reduced, whereas those of TNFα were unimpaired in cryopyrin knock-out mice after injection with poly(I:C) (Fig. 8, A–D and G, and supplemental Fig. 1). The reduced levels of IL-6 detected in the serum of cryopyrinnull mice after stimulation with poly(I:C) is presumably due to the induction of IL-6 by IL-1β in vivo (43Netea M.G. Kullberg B.J. Verschueren I. Van Der Meer J.W. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 3057-3060Crossref PubMed Scopus (102) Google Scholar). Notably, the production of pro-inflammatory cytokines including IL-1β was unimpaired in cryopyrin-deficient mice after intraperitoneal administration of Pam3CSK4, demonstrating the specific role of cryopyrin in regulating poly(I:C) responses in vivo. Infection of monocytes and macrophages with a variety of viruses is known to induce the secretion of IL-1β and IL-18 through the activation of caspase-1, but the molecular mechanisms involved have remained largely unknown. These studies demonstrate that cryopyrin plays an essential role in the secretion of IL-1β and IL-18 by sensing viral dsRNA and inducing the activation of caspase-1. Viral dsRNA also triggers the production of type I IFNs, TNFα, and IL-6 through TLR3 and the RIG-1 stimulation (4Alexopoulou L. Holt A.C. Medzhitov R. Flavell R.A. Nature. 2001; 413: 732-738Crossref PubMed Scopus (4936) Google Scholar, 11Kato H. Sato S. Yoneyama M. Yamamoto M. Uematsu S. Matsui K. Tsujimura T. Takeda K. Fujita T. Takeuchi O. Akira S. Immunity. 2005; 23: 19-28Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1110) Google Scholar), but these immune responses were independent of cryopyrin. The latter responses are mediated through the activation of the transcriptional factors IRF3/IRF7 and NFκB (16Sato M. Suemori H. Hata N. Asagiri M. Ogasawara K. Nakao K. Nakaya T. Katsuki M. Noguchi S. Tanaka N. Taniguchi T. Immunity. 2000; 13: 539-548Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1096) Google Scholar, 44Takaoka A. Taniguchi T. Cancer Sci. 2003; 94: 405-411Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). Thus, dsDNA induces at least three distinct defense-signaling pathways in host cells to limit viral infection. IL-1β and IL-18 are induced by a variety of microbial stimuli through the activation of caspase-1. IL-1β is considered to be a master cytokine in that it mediates several innate and adaptive immune responses directly or through the induction of other cytokines such as IL-6 (43Netea M.G. Kullberg B.J. Verschueren I. Van Der Meer J.W. Eur. J. Immunol. 2000; 30: 3057-3060Crossref PubMed Scopus (102) Google Scholar). In addition, IL-1β is a potent pyrogen that is involved in the development of fever in response to pathogen infection (45Dinarello C.A. Wolff S.M. N. Engl. J. Med. 1993; 328: 106-113Crossref PubMed Scopus (949) Google Scholar). However, there is little evidence for a role of IL-1β in host defense against viral infection. In contrast, IL-18, a cytokine that stimulates nature killer cells and CD8+ T cells and is potently synergistic with IL-12 for this function (46Micallef M.J. Ohtsuki T. Kohno K. Tanabe F. Ushio S. Namba M. Tanimoto T. Torigoe K. Fujii M. Ikeda M. Fukuda S. Kurimoto M. Eur. J. Immunol. 1996; 26: 1647-1651Crossref PubMed Scopus (560) Google Scholar), is known to play an important role in viral clearance (47Liu B. Mori I. Hossain M.J. Dong L. Takeda K. Kimura Y. J. Gen. Virol. 2004; 85: 423-428Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar, 48Gherardi M.M. Ramirez J.C. Esteban M. J. Gen. Virol. 2003; 84: 1961-1972Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). Furthermore, administration of IL-18 can protect the host against infection with herpes simplex and vaccinia virus (49Fujioka N. Akazawa R. Ohashi K. Fujii M. Ikeda M. Kurimoto M. J. Virol. 1999; 73: 2401-2409Crossref PubMed Google Scholar, 50Tanaka-Kataoka M. Kunikata T. Takayama S. Iwaki K. Ohashi K. Ikeda M. Kurimoto M. Cytokine. 1999; 11: 593-599Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar). A role for IL-18 in viral infection is also supported by the finding that the genome of several poxviruses encodes proteins that bind and inactivate IL-18 (51Xiang Y. Moss B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 11537-11542Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar). Functional analyses of RNA compounds and enzymatic studies revealed that dsRNA (but not ssRNA) activate caspase-1 through cryopyrin. The ability of cryopyrin to discriminate between dsRNA and ssRNA provides a mechanism to sense viral RNA and to avoid harmful activation of the cryopyrin inflammasome by endogenous RNA. Treatment of 700 bp dsRNA fragments with RNase III, an endoribonuclease that cleaves both synthetic and natural dsRNA into small duplex products averaging 10–18 bp in length (52Dunn J.J. Gene. 1982; 245: 213-221Google Scholar), had no effect on its ability to induce caspase-1 activation. It is known that mammalian RNase III enzymes, such as Dicer, process dsRNA into 21–24-nt dsRNAs that can induce degradation of homologous mRNAs and specific gene silencing (53Carmell M.A. Hannon G.J. Nat. Struct. Mol. Biol. 2004; 11: 214-218Crossref PubMed Scopus (311) Google Scholar). It is also known that certain siRNAs can induce IFN responses and toxic effects in mammalian cells (54Sledz C.A. Holko M. de Veer M.J. Silverman R.H. Williams B.R. Nat. Cell Biol. 2003; 5: 834-839Crossref PubMed Scopus (1221) Google Scholar). Our results suggest both long viral and endogenous dsRNA fragments or their shorter dsRNA products generated by RNase III enzymes might lead to cryopyrin activation and IL-1β/IL-18 secretion. There are several mechanisms by which dsRNA could induce the activation of caspase-1 through cryopyrin. Viral dsRNA is produced during viral infection in the cytosol of host cells and could be sensed directly by cryopyrin. There is evidence that several NLR proteins, including Nod1, Nod2, Ipaf, and cryopyrin, can recognize microbial structures (22Inohara N. Chamaillard M. McDonald C. Núñez G. Annu. Rev. Biochem. 2005; 74: 355-383Crossref PubMed Scopus (812) Google Scholar, 23Ting J.P. Davis B.K. Annu. Rev. Immunol. 2005; 23: 387-414Crossref PubMed Scopus (299) Google Scholar). However, there is no evidence that the microbial products physically interact with the leucine-rich repeats of these NLR proteins (55Mackey D. Holt B.F. II I Wiig A. Dangl J.L. Cell. 2002; 108: 743-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (864) Google Scholar). The sensing of dsRNA by cryopyrin is most likely to be indirect, as it has been proposed for the recognition of microbial components by plant NLR homologs (55Mackey D. Holt B.F. II I Wiig A. Dangl J.L. Cell. 2002; 108: 743-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (864) Google Scholar, 56Mackey D. Belkhadir Y. Alonso J.M. Ecker J.R. Dangl J.L. Cell. 2003; 112: 379-389Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (727) Google Scholar). Cryopyrin has been shown to form a large multiprotein complex containing ASC that promotes the activation of caspase-1 in cell-free systems (25Agostini L. Martinon F. Burns K. McDermott M.F. Hawkins P.N. Tschopp J. Immunity. 2004; 20: 319-325Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1389) Google Scholar). Thus, a possible model is that the leucine-rich repeats of cryopyrin sense dsRNA produced during viral infection, which induces the oligomerization of cryopyrin and recruitment of caspase-1 via ASC and possibly other factors involved in caspase-1 activation. In summary, our results have shown a novel role for cryopyrin in the activation of inflammasome by dsRNA/viral RNA and by viral infection. These findings provide important insight into the role of NLR proteins in the host response to dsRNA. The possibility that certain siRNAs might activate the cryopyrin inflammasome warrant further investigation, as such siRNAs are being explored for their potential therapeutic use (57Jacque J.M. Triques K. Stevenson M. Nature. 2002; 418: 435-438Crossref PubMed Scopus (768) Google Scholar, 58Gitlin L. Karelsky S. Andino R. Nature. 2002; 418: 430-434Crossref PubMed Scopus (519) Google Scholar). We thank Anthony Coyle, Ethan Grant, and John Bertin (Millennium Pharmaceuticals) and Shizuo Akira (Osaka University) for the generous supply of mutant mice, P. Vandenabeele for anti-caspase-1 antibody, C. Kao for Brome mosaic viral RNA, and the Cellular Immunology Core Facility of the University of Michigan Cancer Center for technical support. Download .pdf (.11 MB) Help with pdf files

Abstract A common denominator among the multiple damage-inducing agents that ultimately lead to activation of NLRP3 has not yet been identified. Recently, production of reactive oxygen species (ROS) has been suggested to act as a common event upstream of the NLRP3 inflammasome machinery. Because de novo translation of NLRP3 is an essential step in the activation of NLRP3, we investigated the role of substances that inhibit either ROS production or its oxidative activity. Although we observe that NLRP3 inflammasome activation is unique among other known inflammasomes in its sensitivity to ROS inhibition, we have found that this phenomenon is attributable to the fact that NLRP3 strictly requires priming by a proinflammatory signal, a step that is blocked by ROS inhibitors. Although these data do not exclude a general role for ROS production in the process of NLRP3-triggered inflammation, they would put ROS upstream of NLRP3 induction, but not activation.

Abstract Several mechanistically distinct models of nonclassical secretion, including exocytosis of secretory lysosomes, shedding of plasma membrane microvesicles, and direct efflux through plasma membrane transporters, have been proposed to explain the rapid export of caspase-1-processed IL-1β from monocytes/macrophages in response to activation of P2X7 receptors (P2X7R) by extracellular ATP. We compared the contribution of these mechanisms to P2X7R-stimulated IL-1β secretion in primary bone marrow-derived macrophages isolated from wild-type, P2X7R knockout, or apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal CARD knockout mice. Our experiments revealed the following: 1) a novel correlation between IL-1β secretion and the release of the MHC-II membrane protein, which is a marker of plasma membranes, recycling endosomes, multivesicular bodies, and released exosomes; 2) a common and absolute requirement for inflammasome assembly and active caspase-1 in triggering the cotemporal export of IL-1β and MHC-II; and 3) mechanistic dissociation of IL-1β export from either secretory lysosome exocytosis or plasma membrane microvesicle shedding on the basis of different requirements for extracellular Ca2+ and differential sensitivity to pharmacological agents that block activation of caspase-1 inflammasomes. Thus, neither secretory lysosome exocytosis nor microvesicle shedding models constitute the major pathways for nonclassical IL-1β secretion from ATP-stimulated murine macrophages. Our findings suggest an alternative model of IL-1β release that may involve the P2X7R-induced formation of multivesicular bodies that contain exosomes with entrapped IL-1β, caspase-1, and other inflammasome components.

Shigella infection, the cause of bacillary dysentery, induces caspase-1 activation and cell death in macrophages, but the precise mechanisms of this activation remain poorly understood. We demonstrate here that caspase-1 activation and IL-1β processing induced by Shigella are mediated through Ipaf, a cytosolic pattern-recognition receptor of the nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor (NLR) family, and the adaptor protein apoptosis-associated speck-like protein containing a C-terminal caspase recruitment domain (ASC). We also show that Ipaf was critical for pyroptosis, a specialized form of caspase-1-dependent cell death induced in macrophages by bacterial infection, whereas ASC was dispensable. Unlike that observed in Salmonella and Legionella, caspase-1 activation induced by Shigella infection was independent of flagellin. Notably, infection of macrophages with Shigella induced autophagy, which was dramatically increased by the absence of caspase-1 or Ipaf, but not ASC. Autophagy induced by Shigella required an intact bacterial type III secretion system but not VirG protein, a bacterial factor required for autophagy in epithelial-infected cells. Treatment of macrophages with 3-methyladenine, an inhibitor of autophagy, enhanced pyroptosis induced by Shigella infection, suggesting that autophagy protects infected macrophages from pyroptosis. Thus, Ipaf plays a critical role in caspase-1 activation induced by Shigella independently of flagellin. Furthermore, the absence of Ipaf or caspase-1, but not ASC, regulates pyroptosis and the induction of autophagy in Shigella-infected macrophages, providing a novel function for NLR proteins in bacterial–host interactions.

Abstract The Nlrp3 inflammasome is critical for the activation of caspase-1 in response to danger signals and particulate matter. However, its role in sterile inflammation remains unclear because prestimulation of phagocytic cells with microbial molecules is required for caspase-1 activation. We show here that exposure of macrophages and dendritic cells to TNF-α promotes ATP- or silica-mediated caspase-1 activation and IL-1β secretion in the absence of microbial stimulation. The effect of TNF-α was abolished in macrophages deficient in TNF receptor I and II, Nlrp3, or ASC, whereas that induced by TLR ligands required MyD88/Trif. In addition to TNF-α, IL-1α and IL-1β promoted caspase-1 activation via Nlrp3 in response to ATP. Remarkably, macrophages tolerized to TNF-α, but not to LPS, retained full sensitivity to ATP stimulation via Nlrp3. These results provide a mechanism by which danger signals and particulate matter mediate inflammation via the Nlrp3 inflammasome in the absence of microbial infection.

Cryopyrin is essential for caspase-1 activation triggered by Toll-like receptor (TLR) ligands in the presence of adenosine triphosphate (ATP). However, the events linking bacterial products and ATP to cryopyrin remain unclear. Here we demonstrate that cryopyrin-mediated caspase-1 activation proceeds independently of TLR signaling, thus dissociating caspase-1 activation and IL-1β secretion. Instead, caspase-1 activation required pannexin-1, a hemichannel protein that interacts with the P2X7 receptor. Direct cytosolic delivery of multiple bacterial products including lipopolysaccharide, but not flagellin, induced caspase-1 activation via cryopyrin in the absence of pannexin-1 activity or ATP stimulation. However, unlike Ipaf-dependent caspase-1 activation, stimulation of the pannexin-1-cryopyrin pathway by several intracellular bacteria was independent of a functional bacterial type III secretion system. These results provide evidence for cytosolic delivery and sensing of bacterial molecules as a unifying model for caspase-1 activation and position pannexin-1 as a mechanistic link between bacterial stimuli and the cryopyrin inflammasome.