Hereditary multiple exostoses, a dominantly inherited genetic disorder characterized by multiple cartilaginous tumors, is caused by mutations in members of the EXT gene family, EXT1 or EXT2 . The proteins encoded by these genes, EXT1 and EXT2, are endoplasmic reticulum-localized type II transmembrane glycoproteins that possess or are tightly associated with glycosyltransferase activities involved in the polymerization of heparan sulfate. Here, by testing a cell line with a specific defect in EXT1 in in vivo and in vitro assays, we show that EXT2 does not harbor significant glycosyltransferase activity in the absence of EXT1. Instead, it appears that EXT1 and EXT2 form a hetero-oligomeric complex in vivo that leads to the accumulation of both proteins in the Golgi apparatus. Remarkably, the Golgi-localized EXT1/EXT2 complex possesses substantially higher glycosyltransferase activity than EXT1 or EXT2 alone, which suggests that the complex represents the biologically relevant form of the enzyme(s). These findings provide a rationale to explain how inherited mutations in either of the two EXT genes can cause loss of activity, resulting in hereditary multiple exostoses.

Hereditary multiple exostoses, characterized by multiple cartilaginous tumors, is ascribed to mutations at three distinct loci, denoted EXT1–3. Here, we report the purification of a protein from bovine serum that harbored thed-glucuronyl (GlcA) and N-acetyl-d-glucosaminyl (GlcNAc) transferase activities required for biosynthesis of the glycosaminoglycan, heparan sulfate (HS). This protein was identified as EXT2. Expression of EXT2 yielded a protein with both glycosyltransferase activities. Moreover, EXT1, previously found to rescue defective HS biosynthesis (McCormick, C., Leduc, Y., Martindale, D., Mattison, K., Esford, L. E., Dyer, A. P., and Tufaro, F. (1998) Nat. Genet. 19, 158–161), was shown to elevate the low GlcA and GlcNAc transferase levels of mutant cells. Thus at least two members of the EXT family of tumor suppressors encode glycosyltransferases involved in the chain elongation step of HS biosynthesis. Hereditary multiple exostoses, characterized by multiple cartilaginous tumors, is ascribed to mutations at three distinct loci, denoted EXT1–3. Here, we report the purification of a protein from bovine serum that harbored thed-glucuronyl (GlcA) and N-acetyl-d-glucosaminyl (GlcNAc) transferase activities required for biosynthesis of the glycosaminoglycan, heparan sulfate (HS). This protein was identified as EXT2. Expression of EXT2 yielded a protein with both glycosyltransferase activities. Moreover, EXT1, previously found to rescue defective HS biosynthesis (McCormick, C., Leduc, Y., Martindale, D., Mattison, K., Esford, L. E., Dyer, A. P., and Tufaro, F. (1998) Nat. Genet. 19, 158–161), was shown to elevate the low GlcA and GlcNAc transferase levels of mutant cells. Thus at least two members of the EXT family of tumor suppressors encode glycosyltransferases involved in the chain elongation step of HS biosynthesis. heparan sulfate GlcA transferase GlcNAc transferase HS-polymerase hereditary multiple exostoses polyacrylamide gel electrophoresis base pair(s) phosphate-buffered saline 3-(cyclohexylamino)propanesulfonic acid. Heparan sulfate (HS)1proteoglycans, ubiquitously distributed on cell surfaces and in the extracellular matrix, consist of sulfated glycosaminoglycan chains that are covalently bound to various core proteins. HS polysaccharide, increasingly implicated in physiological processes such as cell adhesion, cytokine action, and regulation of enzymic catalysis, owes its biological properties to interactions with various proteins, mediated by specific saccharide sequences. Biosynthesis of HS chains involves the formation of an initial, simple polysaccharide, composed of alternating d-glucuronic acid (GlcA) and N-acetyl-d-glucosamine (GlcNAc) units, joined by 1→4 linkages. This polymer is subsequently modified through a series of reactions, which involves partial N-deacetylation and N-sulfation of GlcNAc units, C-5 epimerization of GlcA tol-iduronic acid residues, and O-sulfation at various positions (1Salmivirta M. Lidholt K. Lindahl U. FASEB J. 1996; 10: 1270-1279Crossref PubMed Scopus (396) Google Scholar). The GlcA transferase (GlcA-T) and GlcNAc transferase (GlcNAc-T) reactions required to generate the initial HS polysaccharide precursor have been associated with a single protein (2Lidholt K. Weinke J.L. Kiser C.S. Lugemwa F.N. Bame K.J. Cheifetz S. Massagué J. Lindahl U. Esko J.D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1992; 89: 2267-2271Crossref PubMed Scopus (236) Google Scholar), hereafter referred to as “HS-polymerase” (HS-POL). Partial purification of proteins from bovine serum revealed a ∼70-kDa component with both activities (3Lind T. Lindahl U. Lidholt K. J. Biol. Chem. 1993; 268: 20705-20708Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). We now report the molecular cloning of this protein and demonstrate that it is 94% identical to human EXT2, a member of the EXT family of tumor suppressors. Also EXT1, another member of the same family (4Cook A. Raskind W. Blanton S.H. Pauli R.M. Gregg R.G. Francomano C.A. Puffenberger E. Conrad E.U. Schmale G. Schellenberg G. Wijsman E. Hecht J.T. Wells D. Wagner M.J. Am. J. Hum. Genet. 1993; 53: 71-79PubMed Google Scholar, 5LeMerrer M. Legeai-Mallet L. Jeannin P.M. Horsthemke B. Schinzel A. Plauchu H. Toutain A. Achard F. Munnich A. Maroteaux P. Hum. Mol. Genet. 1994; 3: 717-722Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar, 6Wu Y.Q. Heutink P. deVries B.B.A. Sandkuijl L.A. van den Ouweland A.M.W. Niermeijer M.F. Galjaard H. Reyneirs E. Willems P.J. Halley D.J.J. Hum. Mol. Genet. 1994; 3: 167-171Crossref PubMed Scopus (149) Google Scholar, 7Ahn J. Lüdecke H.-J. Lindow S. Horton W.A. Lee B. Wagner M.J. Horsthemke B. Wells D.E. Nat. Genet. 1995; 11: 137-143Crossref PubMed Scopus (374) Google Scholar), is implicated with similar catalytic activities. Mutations of EXT genes have been associated with the development of hereditary multiple exostoses (HME), the most frequent of all skeletal dysplasias. These findings suggest that alterations in the formation of the HS precursor polysaccharide may be involved in tumor formation and further point to an important role for HS in control of bone growth. The polymerase was isolated from bovine serum using an extension of the protocol described previously (3Lind T. Lindahl U. Lidholt K. J. Biol. Chem. 1993; 268: 20705-20708Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Briefly, the procedure involved successive chromatographies through the following matrices: Red-Sepharose, concanavalin A-Sepharose connected to Red-Sepharose (recirculation for 48 h), phenyl-Sepharose, Superdex 200 (gel chromatography), UDP-Sepharose, Mono Q (anion-exchange chromatography), and Mono P (chromatofocusing). The product was finally separated by preparative SDS-PAGE and stained with Coomassie Blue. The implicated ∼70-kDa component was digested with trypsin in the gel, and the resultant peptides were separated and sequenced as described (8Rosenfeld J. Capdevielle J. Guillemont J.C. Ferrara P. Anal. Biochem. 1992; 203: 173-179Crossref PubMed Scopus (1130) Google Scholar). The cDNA probe used for screening was derived from a human EST clone (826 bp) from Soares fetal liver spleen library (GenBank accession no. U13869(IMAGE Consortium)). The clone was excised from vector pT7T3D (Amersham Pharmacia Biotech) with PacI and EcoRI and was labeled with [α-32P]dCTP, using a random-priming kit (Boehringer Mannheim). Nitrocellulose replicas of plaques from the bacteriophage λgt10 bovine kidney cDNA library (catalog no. BL3001a; CLONTECH) were hybridized with the labeled probe according to the instructions of the manufacturers. The nucleotide sequences of cDNAs were determined by repeated sequencing of both strands of alkaline-denatured plasmid DNA using the Cy5 AutoRead sequencing kit (Amersham Pharmacia Biotech). Nucleotide sequences were labeled using a Cy5-dATP labeling mix, and the sequencing reactions were performed using T7 DNA polymerase. Sequences were determined on an ALFexpress system (Amersham Pharmacia Biotech) and analyzed using the DNA-Star (DNASTAR Inc., Wisconsin) program. The nucleotide and protein sequences were applied to data base screening using BLAST search, NCBI (Internet address:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). The 2884-bp cDNA insert recovered from the bovine kidney cDNA library was cleaved with restriction enzyme BseRI to generate a 2256-bp fragment (corresponding to nucleotides 185–2441), which was then treated with Klenow fragment to generate blunt ends. This product was ligated into a pcDNA3 expression vector (Invitrogen), modified to introduce a His/FLAG (MGGSHHHHHHDYKDDDDK-) tag at the N terminus. COS-7 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium-F12 (catalog no. 31330-038, Life Technologies, Inc.) supplemented with 50 units/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin, and 10% (v/v) heat-inactivated (56 °C, 30 min) fetal calf serum at 37 °C and 7.5% CO2. For electrotransfection 70% confluent cells in a 175-cm2 flask were trypsinized and washed with PBS supplemented with 10 mm Hepes, 2 mmMgCl2, pH 7.2. The cells were resuspended in 500 μl of washing buffer, and 30 μg of plasmid cDNA was added along with 50 μg of fish sperm carrier DNA (Boehringer Mannheim). Electrotransfection was carried out in a 0.4-cm cuvette (BTX) at 360 V and 500 microfarads. Following transfection the cells were resuspended in culture medium containing 2% Me2SO, transferred to a 10-cm culture dish, left at room temperature for 20 min, and finally incubated at 37 °C for 72 h. Protein was analyzed on 10% polyacrylamide gel in SDS, on a Bio-Rad MiniProtean unit, according to the manufacturer's instruction. For Western detection, separated proteins were transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (Millipore) in a Bio-Rad Trans-Blot semidry electroblot system, using 10 mm CAPS, 5% MeOH, pH 11, as transfer buffer at 6 V for 40 min. The membrane was blocked with PBS, 0.1% Tween 20, and 15% bovine serum and was then incubated with the anti-FLAG M2 antibody (Kodak) in the same solution. After washing, the His/FLAG-tagged HS-POL was detected using a chemiluminescence kit (ECL; Amersham Pharmacia Biotech), and the signal was recorded on a Bio-Rad G525 phosphoimaging device. Cell lines analyzed for GlcA-T and GlcNAc-T activities included clone 1D from Lmtk− mouse fibroblasts, mutant gro2C derived from the same cells (9Gruenheid S. Gatzke L. Meadows H. Tufaro F. J. Virol. 1993; 67: 93-100Crossref PubMed Google Scholar), COS-7 cells, and transfected variants as indicated. After washing with PBS cells were scraped off in 50 mmHepes, 0.15 m NaCl, 1% Triton X-100, pH 7.2, and lysed by incubation with gentle agitation at 4 °C for 1 h. The lysates were centrifuged at 16,000 × g for 10 min, and supernatants were subjected to glycosyltransferase assays as described before (3Lind T. Lindahl U. Lidholt K. J. Biol. Chem. 1993; 268: 20705-20708Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Briefly, GlcA-T activity was measured by incubating lysates with UDP-[14C]GlcA and a GlcNAc-[GlcA-GlcNAc]noligosaccharide acceptor (nonreducing terminal GlcNAc unit), whereas GlcNAc-T was assayed by similar incubation with UDP-[3H]GlcNAc and a [GlcA-GlcNAc]n acceptor (nonreducing terminal GlcA unit). Labeled oligosaccharides were isolated and quantified by scintillation counting. The putative HS-POL isolated previously from bovine serum (3Lind T. Lindahl U. Lidholt K. J. Biol. Chem. 1993; 268: 20705-20708Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) was subjected to further purification through a series of chromatography steps (see “Materials and Methods”). The GlcA- and GlcNAc-T activities remained associated throughout this procedure. Final separation by SDS-PAGE yielded a ∼70-kDa protein, which was isolated, and four tryptic peptides were sequenced. One of the peptides, residues 129–147 in Fig. 1, matched a human EST cDNA containing a 257-amino acid residue open reading frame. The EST clone was used to screen a bovine kidney cDNA library, which yielded a 2884-bp cDNA with a coding region of 2154 bp, corresponding to a protein of 718 amino acids (Fig. 1). This cDNA was identified as EXT2. Sequence analysis of the predicted protein suggested that it adopts a type II configuration typical of glycosyltransferases (10Paulson J.C. Colley K.J. J. Biol. Chem. 1989; 264: 17615-17618Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) with a short N-terminal cytoplasmic tail, a transmembrane region, and a large lumenal domain with two potential N-glycosylation sites, as has been shown for EXT1 (11McCormick C. Leduc Y. Martindale D. Mattison K. Esford L.E. Dyer A.P. Tufaro F. Nat. Genet. 1998; 19: 158-161Crossref PubMed Scopus (326) Google Scholar). The calculatedM r is 81,900, somewhat larger than the apparentM r of the purified protein. It appears that the purified bovine HS-POL is a truncated form that has lost its transmembrane domain and been subsequently released from the cell, as is well established for glycosyltransferases (10Paulson J.C. Colley K.J. J. Biol. Chem. 1989; 264: 17615-17618Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Direct evidence that the cloned bovine HS-POL cDNA encodes a protein with both GlcA- and GlcNAc-T activities was obtained by expressing the His/FLAG fusion protein in COS-7 cells. Western blots of cell lysates using anti-FLAG antibodies showed a protein product of the appropriate size (Fig. 2). The fusion protein was recovered on an anti-FLAG affinity gel and assayed for GlcA- and GlcNAc-T activities. The apparent activities were ∼4- and ∼10-fold elevated, respectively, compared with mock-transfected controls (Fig. 3). The transferase activities displayed by control cells were probably because of endogenous enzymes committed to HS biosynthesis.Figure 3Assay of GlcNAc-T and GlcA-T activities following transfection of COS-7 cells with bovine HS-POL-His/FLAG fusion protein (see “Materials and Methods”). Expressed protein was bound to anti-FLAG M2 monoclonal antibody immobilized to agarose (Kodak) in PBS, 0.1% Triton X-100 by batch incubation at room temperature for 1 h and eluted with 0.14 mm FLAG octapeptide (DYKDDDDK) in the same buffer. Glycosyltransferase assays were performed as described under “Materials and Methods.” Thebars indicate values derived from two independent experiments.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) A recent report shows that defective HS biosynthesis in a mutant mouse fibroblast cell line (gro2C) could be partially rescued by transfection with EXT1 (11McCormick C. Leduc Y. Martindale D. Mattison K. Esford L.E. Dyer A.P. Tufaro F. Nat. Genet. 1998; 19: 158-161Crossref PubMed Scopus (326) Google Scholar). We therefore decided to analyze the gro2C cells as well as the corresponding wild-type L cells for the two glycosyltransferase activities, before and after transfection with EXT1. Both activities were 5–10-fold lower in the mutant than in the wild-type cell lysates (Table I), indicating that the abrogated HS biosynthesis in gro2C cells is probably caused by defects in HS-POL. Transfection of gro2C cells with EXT1 showed a ∼2-fold increase in both enzymatic activities (Table I), which suggested that EXT1, like EXT2, harbors HS-POL activities.Table IGlcNAc-T and GlcA-T activities in gro2C cells and L cells, with or without overexpression of EXT1CellGlcNAc-T activityGlcA-T activitycpm Hcpm CHS mutant gro2C180 ± 20200 ± 40 gro2C EXT1310 ± 40370 ± 110Wild type L890 ± 801900 ± 200 L EXT1570 ± 1001100 ± 100Cells were grown and lysed as described under “Materials and Methods,” and GlcA-T and GlcNAc-T activities were determined. Values indicate counts/min of [3H]GlcNAc and [14C]GlcA incorporated per mg of protein per min and represent means ± S.D. of four independent assays. Open table in a new tab Cells were grown and lysed as described under “Materials and Methods,” and GlcA-T and GlcNAc-T activities were determined. Values indicate counts/min of [3H]GlcNAc and [14C]GlcA incorporated per mg of protein per min and represent means ± S.D. of four independent assays. By contrast, transfection of control L cells with EXT1 led to a decrease in HS-POL activities (Table I). A similar decrease in polymerase activities was noted after transfection of COS-7 cells with bovine HS-POL/EXT2, thus explaining why expression of recombinant enzyme was detectable in terms of catalytic activity only after recovery of fusion protein by immunoabsorption. These results suggested that overexpression of either EXT1 or EXT2 proteins interfered with the apparent activity in normal cells. The HS produced by such transfected cells showed a somewhat lower apparent negative charge density than corresponding control HS, as demonstrated by ion-exchange chromatography of HS from control and EXT1-transfected L cells (Fig. 2 in Ref. 11McCormick C. Leduc Y. Martindale D. Mattison K. Esford L.E. Dyer A.P. Tufaro F. Nat. Genet. 1998; 19: 158-161Crossref PubMed Scopus (326) Google Scholar) and HS from control and HS-POL-transfected human kidney epithelial 293 cells (Fig. 4). HME is characterized by the formation of cartilage-capped tumors (exostoses), which are derived from the growth plate of endochondral bone (12Solomon L. J. Bone Jt. Surg. Br. Vol. 1963; 45B: 292-304Crossref Google Scholar) and may lead to skeletal abnormalities and short stature. Malignant transformation into chondrosarcomas (13Leone N.C. Shupe J.L. Gardner E.J. Millar E.A. Olson A.E. Phillips E.C. J. Hered. 1987; 78: 171-177Crossref PubMed Scopus (35) Google Scholar, 14Hennekam R.C.M. J. Med. Genet. 1991; 28: 262-266Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar) or osteosarcomas (15Schmale G.A. Conrad E.U. Raskind W.H. J. Bone Jt. Surg. Am. Vol. 1994; 76: 986-992Crossref PubMed Scopus (458) Google Scholar, 16Luckert Wicklund C. Pauli R.M. Johnston D. Hecht J.T. Am. J. Med. Genet. 1995; 55: 43-46Crossref PubMed Scopus (248) Google Scholar) has been described. Three genes have been associated with this autosomal dominant disorder, EXT1 on 8q24.1, EXT2 on 11p11–13, and EXT3 on 19p (5LeMerrer M. Legeai-Mallet L. Jeannin P.M. Horsthemke B. Schinzel A. Plauchu H. Toutain A. Achard F. Munnich A. Maroteaux P. Hum. Mol. Genet. 1994; 3: 717-722Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar, 7Ahn J. Lüdecke H.-J. Lindow S. Horton W.A. Lee B. Wagner M.J. Horsthemke B. Wells D.E. Nat. Genet. 1995; 11: 137-143Crossref PubMed Scopus (374) Google Scholar, 17Stickens D. Clines G. Burbee D. Ramos P. Thomas S. Hogue D. Hecht J.T. Lovett M. Evans G.A. Nat. Genet. 1996; 14: 25-32Crossref PubMed Scopus (292) Google Scholar, 18Wuyts W. Van Hul W. Wauters J. Nemtsova M. Reyniers E. Van Hul E.V. De Boulle K. de Vries B.B. Hendrickx J. Herrygers I. Bossuyt P. Balemans W. Fransen E. Vits L. Coucke P. Nowak N.J. Shows T.B. Mallet L. van den Ouweland A.M. McGaughran J. Halley D.J. Willems P.J. Hum. Mol. Genet. 1996; 5: 1547-1557Crossref PubMed Scopus (167) Google Scholar). Recently, several novel genes have been identified that share significant sequence homology with the EXT genes (19Wise C.A. Clines G.A. Massa H. Trask B.J. Lovett M. Genome Res. 1997; 7: 10-16Crossref PubMed Scopus (121) Google Scholar, 20Wuyts W. Van Hul W. Hendrickx J. Speleman F. Wauters J. De Boulle K. Van Roy N. Van Agtmael T. Bossuyt P. Willems P.J. Eur. J. Hum. Genet. 1997; 5: 382-389Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar, 21Van Hul W. Wuyts W. Hendrickx J. Speleman F. Wauters J. De Boulle K. Van Roy N. Bossuyt P. Willems P.J. Genomics. 1998; 47: 230-237Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar). Although none of these have been linked with HME, their chromosomal localizations suggest association with other forms of cancer. The findings in this report show that EXT1 and EXT2 both encode a HS-POL. It is tempting to speculate that other members of the EXT family are similarly involved in the biosynthesis of glycosaminoglycans. The precise defect in HS biosynthesis in HME is unclear. Complete elimination of HS-POL activities would result in total absence of the polysaccharide. Partial loss of activity might lead to the formation of fewer and/or shorter chains. However, it seems likely that the polymerase interacts with one or more of the enzymes that catalyze the various modification reactions through which the nonsulfated precursor polysaccharide is converted into the mature, sulfated product (1Salmivirta M. Lidholt K. Lindahl U. FASEB J. 1996; 10: 1270-1279Crossref PubMed Scopus (396) Google Scholar, 22Lidholt K. Lindahl U. Biochem. J. 1992; 289: 21-29Crossref Scopus (60) Google Scholar). A mutation in the appropriate EXT protein might affect such interaction as well as the initial polymerization reaction itself, with presently unpredictable effects on the structure of the final product. Indeed, many different types of tumors are associated with distinct changes in glycosaminoglycan, particularly HS, structure (23Winterbourne D.J. Mora P.T. J. Biol. Chem. 1981; 256: 4310-4320Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 24Pejler G. David G. Biochem. J. 1987; 248: 69-77Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar, 25Nakanishi H. Oguri K. Yoshida K. Itano N. Takenaga K. Kazama T. Yoshida A. Okayama M. Biochem. J. 1992; 288: 215-224Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar, 26Jayson G.C. Lyon M. Paraskeva C. Turnbull J.E. Deakin J.A. Gallagher J.T. J. Biol. Chem. 1998; 273: 51-57Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (121) Google Scholar, 27Safaiyan F. Lindahl U. Salmivirta M. Eur. J. Biochem. 1998; 252: 576-582Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar). Although the mechanisms behind these changes are generally unknown, the alterations may be expected to affect functional interactions with a variety of proteins that are potentially involved in neoplastic transformation. Examples of such proteins include a variety of growth factors that may be functionally dependent on HS fine structure (28Guimond S. Maccarana M. Olwin B.B. Lindahl U. Rapraeger A.C. J. Biol. Chem. 1993; 268: 23906-23914Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), growth factor receptors, extracellular matrix macromolecules (29Oh E.-S. Woods A. Couchman J.R. J. Biol. Chem. 1997; 272: 8133-8136Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (250) Google Scholar), and HS-degrading endoglycosidase(s) (heparanase) (30Vlodavsky I. Mohsen M. Lider O. Svahn C.M. Ekre H.P. Vigoda M. Ishai-Michaeli R. Peretz T. Invasion Metastasis. 1995; 14: 290-302Google Scholar). Interestingly, aDrosophila homologue of EXT1 was recently implicated with the diffusion of Hedgehog, a presumably glycosaminoglycan-dependent process in embryonic development (31Bellaiche Y. The I. Perrimon N. Nature. 1998; 394: 85-88Crossref PubMed Scopus (436) Google Scholar). The present findings raise intriguing questions regarding the number of EXT type HS-POLs and the functional relation between these enzymes. Notably, deletion of either EXT1 or EXT2 causes disease, suggesting that these enzymes are not able to substitute for each other. We know that several of the polymer-modifying enzymes, acting further downstream in the process, have also recently been found to occur in genetically distinct isoforms (32Lindahl U. Kusche-Gullberg M. Kjellén L. J. Biol. Chem. 1998; 273: 24979-24982Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (574) Google Scholar). It has been proposed that HS chains with specifically tailored structure (designed for interactions with defined proteins) may be generated through the appropriate combination of such isoforms in biosynthetic assembly systems (32Lindahl U. Kusche-Gullberg M. Kjellén L. J. Biol. Chem. 1998; 273: 24979-24982Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (574) Google Scholar, 33Rosenberg R.D. Shworak N.W. Liu J. Schwartz J.J. Zhang L. J. Clin. Invest. 1997; 99: 2062-2070Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar). Interactions involving EXT proteins at the cellular level are inferred from the consistent down-regulation of overall HS-POL activities because of transfection of cells with either EXT1 or EXT2. Understanding the role of HS biosynthesis in relation to HME, and possibly other types of neoplastic disease, will require detailed analysis of the expression of EXT/HS-POLs in different cells and tissues, as well as of their interaction with other components of the HS biosynthetic machinery.

Abstract Plant cell walls are comprised of cellulose, hemicellulose, and lignin, collectively known as lignocellulose. Microorganisms degrade these components to liberate sugars to meet metabolic demands. Using a metagenomic sequencing approach, we previously demonstrated that the microbiome of the North American porcupine ( Erethizon dorsatum ) is replete with novel lignocellulose-degrading enzymes. Here, we report the identification, synthesis and partial characterization of four genes from the porcupine microbiome encoding putative novel lignocellulose-degrading enzymes, including a β-xylanase, endoxylanase, β-glucosidase, and an ⍺-L-arabinofuranosidase. These genes were identified via conserved catalytic domains associated with cellulose and hemicellulose degradation. We cloned the putative β-xylanase into the pET26b(+) plasmid, enabling inducible gene expression in Escherichia coli ( E. coli ) and periplasmic localization. We demonstrated IPTG-inducible accumulation of β-xylanase protein but failed to detect xylobiose degrading activity in a reporter assay. Alternative assays may be required to measure activity of this putative β-xylanase. In this report, we describe how a synthetic metagenomic pipeline can be used to identify novel microbial lignocellulose-degrading enzymes and take initial steps to introduce a hemicellulose-degradation pathway into E. coli to enable biofuel production from wood pulp feedstock.

ABSTRACT There is an outstanding need for broadly acting antiviral drugs to combat emerging viral diseases. Here, we report that thiopurines inhibit the replication of the betacoronaviruses HCoV-OC43 and SARS-CoV-2, and to a lesser extent, the alphacoronavirus HCoV-229E. 6-Thioguanine (6-TG) disrupted early stages of infection, limiting synthesis of full-length and subgenomic HCoV RNAs. Furthermore, consistent with our previous report on the effects of thiopurines on influenza A virus glycoproteins, we observed that 6-TG inhibited accumulation of Spike glycoproteins from diverse HCoVs. Specifically, 6-TG treatment decreased the accumulation of Spike proteins and increased their electrophoretic mobility, consistent with Spike migration following the enzymatic removal of N-linked oligosaccharides with Peptide:N-glycosidase F (PNGaseF). SARS-CoV-2 virus-like particles (VLPs) harvested from 6-TG-treated cells were deficient in Spike. 6-TG treatment had a similar effect on lentiviruses pseudotyped with SARS-CoV-2 Spike; lentiviruses could be harvested from cell supernatants but were deficient in Spike and unable to infect human cells bearing ACE2 receptors. Together, these findings from complementary ectopic expression and infection models strongly indicate that defective Spike trafficking and processing is an outcome of 6-TG treatment. At low micromolar doses, the primary known mode of action of 6-TG is selective inhibition of the small GTPase Rac1. However, we observed that selective chemical inhibitors of the small GTPases Rac1, CDC42 and Rho had no effect on Spike processing and accumulation. The GTPase agonist ML099 countered the effects of 6-TG, suggesting that an unknown GTPase could be the relevant 6-TG-target protein involved in regulating Spike processing and accumulation. Overall, these findings provide important clues about the mechanism of action of a candidate antiviral that can broadly target HCoVs and suggest that small GTPases are promising targets for host-targeted antivirals. AUTHOR SUMMARY The COVID-19 pandemic has ignited efforts to repurpose existing drugs as safe and effective antivirals. Rather than directly inhibiting viral enzymes, host-targeted antivirals inhibit host cell processes to indirectly impede viral replication and/or stimulate antiviral responses. Here, we describe a new antiviral mechanism of action for the FDA-approved thiopurine 6-thioguanine. We demonstrate that this thiopurine is a pro-drug that must be metabolized by host enzymes to gain antiviral activity. We show that it can inhibit the replication of several human coronaviruses, including SARS-CoV-2, at least in part by interfering with the processing and accumulation of Spike glycoproteins, thereby impeding assembly of infectious progeny viruses. We provide evidence implicating host cell GTPase enzymes in the antiviral mechanism of action.

ABSTRACT Enveloped viruses, including influenza A viruses (IAVs) and coronaviruses (CoVs), utilize the host cell secretory pathway to synthesize viral glycoproteins and direct them to sites of assembly. Using an image-based high-content screen, we identified two thiopurines, 6-thioguanine (6-TG) and 6-thioguanosine (6-TGo), that selectively disrupted the processing and accumulation of IAV glycoproteins hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). Selective disruption of IAV glycoprotein processing and accumulation by 6-TG and 6-TGo correlated with unfolded protein response (UPR) activation and HA accumulation could be partially restored by the chemical chaperone 4-phenylbutyrate (4PBA). Chemical inhibition of the integrated stress response (ISR) restored accumulation of NA monomers in the presence of 6-TG or 6-TGo, but did not restore NA glycosylation or oligomerization. Thiopurines inhibited replication of the human coronavirus OC43 (HCoV-OC43), which also correlated with UPR/ISR activation and diminished accumulation of ORF1ab and nucleocapsid (N) mRNAs and N protein, which suggests broader disruption of coronavirus gene expression in ER-derived cytoplasmic compartments. The chemically similar thiopurine 6-mercaptopurine (6-MP) had little effect on the UPR and did not affect IAV or HCoV-OC43 replication. Consistent with reports on other CoV Spike (S) proteins, ectopic expression of SARS-CoV-2 S protein caused UPR activation. 6-TG treatment inhibited accumulation of full length S0 or furin-cleaved S2 fusion proteins, but spared the S1 ectodomain. DBeQ, which inhibits the p97 AAA-ATPase required for retrotranslocation of ubiquitinated misfolded proteins during ER-associated degradation (ERAD) restored accumulation of S0 and S2 proteins in the presence of 6-TG, suggesting that 6-TG induced UPR accelerates ERAD-mediated turnover of membrane-anchored S0 and S2 glycoproteins. Taken together, these data indicate that 6-TG and 6-TGo are effective host-targeted antivirals that trigger the UPR and disrupt accumulation of viral glycoproteins. Importantly, our data demonstrate for the first time the efficacy of these thiopurines in limiting IAV and HCoV-OC43 replication in cell culture models. IMPORTANCE Secreted and transmembrane proteins are synthesized in the endoplasmic reticulum (ER), where they are folded and modified prior to transport. During infection, many viruses burden the ER with the task of creating and processing viral glycoproteins that will ultimately be incorporated into viral envelopes. Some viruses refashion the ER into replication compartments where viral gene expression and genome replication take place. This viral burden on the ER can trigger the cellular unfolded protein response (UPR), which attempts to increase the protein folding and processing capacity of the ER to match the protein load. Much remains to be learned about how viruses co-opt the UPR to ensure efficient synthesis of viral glycoproteins. Here, we show that two FDA-approved thiopurine drugs, 6-TG and 6-TGo, induce the UPR in a manner that impedes viral glycoprotein accumulation for enveloped influenza viruses and coronaviruses. These drugs may impede the replication of viruses that require precise tuning of the UPR to support viral glycoprotein synthesis for the successful completion of a replication cycle.

Eukaryotic translation initiation factor 4A (eIF4A) is a helicase that facilitates assembly of the translation preinitiation complex by unwinding structured mRNA 5-prime untranslated regions. Pateamine A (PatA) and silvestrol are natural products that disrupt eIF4A function and arrest translation, thereby triggering the formation of cytoplasmic aggregates of stalled preinitiation complexes known as stress granules (SGs). Here we examined the effects of eIF4A inhibition by PatA and silvestrol on influenza A virus (IAV) protein synthesis and replication in cell culture. Treatment of infected cells with either PatA or silvestrol at early times post-infection results in SG formation, arrest of viral protein synthesis and failure to replicate the viral genome. PatA, which irreversibly binds to eIF4A, sustained long-term blockade of IAV replication following drug withdrawal, and inhibited IAV replication at concentrations that had minimal cytotoxicity. By contrast, the antiviral effects of silvestrol were fully reversible; drug withdrawal caused rapid SG dissolution and resumption of viral protein synthesis. IAV inhibition by silvestrol was invariably associated with cytotoxicity. PatA blocked replication of genetically divergent IAV strains, suggesting common dependence on host eIF4A activity. This study demonstrates the feasibility of targeting core host protein synthesis machinery to prevent viral replication.

Many viruses globally shut off host gene expression to inhibit activation of cell-intrinsic antiviral responses. However, host shutoff is not indiscriminate, since viral proteins and host proteins required for viral replication are still synthesized during shutoff. The molecular determinants of target selectivity in host shutoff remain incompletely understood. Here, we report that the influenza A virus shutoff factor PA-X usurps RNA splicing to selectively target host RNAs for destruction. PA-X preferentially degrades spliced mRNAs, both transcriptome-wide and in reporter assays. Moreover, proximity-labeling proteomics revealed that PA-X interacts with cellular proteins involved in RNA splicing. The interaction with splicing contributes to target discrimination and is unique among viral host shutoff nucleases. This novel mechanism sheds light on the specificity of viral control of host gene expression and may provide opportunities for development of new host-targeted antivirals.

Herpesvirus genomes are decoded by host RNA polymerase II, generating messenger ribonucleic acids (mRNAs) that are post-transcriptionally modified and exported to the cytoplasm. These viral mRNAs have 5 ′ -m7GTP caps and poly(A) tails that should permit assembly of canonical eIF4F cap-binding complexes to initiate protein synthesis. However, we have shown that chemical disruption of eIF4F does not impede KSHV lytic replication, suggesting that alternative translation initiation mechanisms support viral protein synthesis. Here, using polysome profiling analysis, we confirmed that eIF4F disassembly did not affect the efficient translation of viral mRNAs during lytic replication, whereas a large fraction of host mRNAs remained eIF4F-dependent. Lytic replication altered multiple host translation initiation factors (TIFs), causing caspase-dependent cleavage of eIF2α and eIF4G1 and decreasing levels of eIF4G2 and eIF4G3. Non-eIF4F TIFs NCBP1, eIF4E2 and eIF4G2 associated with actively translating messenger ribonucleoprotein (mRNP) complexes during KSHV lytic replication, but their depletion by RNA silencing did not affect virion production, suggesting that the virus does not exclusively rely on one of these alternative TIFs for efficient viral protein synthesis. METTL3, an N6-methyladenosine (m6A) methyltransferase that modifies mRNAs and influences translational efficiency, was dispensable for early viral gene expression and genome replication but required for late gene expression and virion production. METTL3 was also subject to caspase-dependent degradation during lytic replication, suggesting that its positive effect on KSHV late gene expression may be indirect. Taken together, our findings reveal extensive remodelling of TIFs during lytic replication, which may help sustain efficient viral protein synthesis in the context of host shutoff.IMPORTANCE Viruses use host cell protein synthesis machinery to create viral proteins. Herpesviruses have evolved a variety of ways to gain control over this host machinery to ensure priority synthesis of viral proteins and diminished synthesis of host proteins with antiviral properties. We have shown that a herpesvirus called KSHV disrupts normal cellular control of protein synthesis. A host cell protein complex called eIF4F starts translation of most cellular mRNAs, but we observed it is dispensable for efficient synthesis of viral proteins. Several proteins involved in alternative modes of translation initiation were likewise dispensable. However, an enzyme called METTL3 that modifies mRNAs is required for efficient synthesis of certain late KSHV proteins and productive infection. We observed caspase-dependent degradation of several host cell translation initiation proteins during infection, suggesting that the virus alters pools of available factors to favour efficient viral protein synthesis at the expense of host protein synthesis.

Coronavirus (CoV) replication requires efficient cleavage of viral polyproteins into an array of non-structural proteins involved in viral replication, organelle formation, viral RNA synthesis, and host shutoff. Human CoVs (HCoVs) encode two viral cysteine proteases, main protease (Mpro) and papain-like protease (PLpro), that mediate polyprotein cleavage. Using a structure-guided approach, a phenothiazine urea derivative that inhibits both SARS-CoV-2 Mpro and PLpro protease activity in vitro was identified. In silico docking studies also predicted binding of the phenothiazine to the active sites of Mpro and PLpro from distantly related alphacoronavirus, HCoV-229E (229E) and the betacoronavirus, HCoV-OC43 (OC43). The lead phenothiazine urea derivative displayed broad antiviral activity against all three HCoVs tested in cell culture infection models. It was further demonstrated that the compound inhibited 229E and OC43 at an early stage of viral replication, with diminished formation of viral replication organelles and the RNAs that are made within them, as expected following viral protease inhibition. These observations suggest that the phenothiazine urea derivative inhibits viral replication and may broadly inhibit proteases of diverse coronaviruses.

Herpesviruses usurp host cell protein synthesis machinery to convert viral mRNAs into proteins, and the endoplasmic reticulum (ER) to ensure proper folding, post-translational modification and trafficking of secreted viral proteins. Overloading ER folding capacity activates the unfolded protein response (UPR), whereby displacement of the ER chaperone BiP activates UPR sensor proteins ATF6, PERK and IRE1 to initiate transcriptional responses to increase catabolic processes and ER folding capacity, while suppressing bulk protein synthesis. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) can be reactivated from latency by chemical induction of ER stress, whereby the IRE1 endoribonuclease cleaves XBP1 mRNA, resulting in a ribosomal frameshift that yields the XBP1s transcription factor that transactivates the promoter of K-RTA, the viral lytic switch protein. By incorporating XBP1s responsive elements in the K-RTA promoter KSHV appears to have evolved a mechanism to respond to ER stress. Here, we report that following reactivation from latency, KSHV lytic replication causes activation of ATF6, PERK and IRE1 UPR sensor proteins. UPR sensor activation is required for efficient KSHV lytic replication; genetic or pharmacologic inhibition of each UPR sensor diminishes virion production. Despite strong UPR sensor activation during KSHV lytic replication, downstream UPR transcriptional responses were restricted; 1) ATF6 was cleaved to release the ATF6(N) transcription factor but known ATF6(N)-responsive genes were not transcribed; 2) PERK phosphorylated eIF2α but ATF4 did not accumulate as expected; 3) IRE1 caused XBP1 mRNA splicing, but XBP1s protein failed to accumulate and XBP1s-responsive genes were not transcribed. Remarkably, complementation of XBP1s deficiency during KSHV lytic replication by ectopic expression inhibited the production of infectious virions in a dose-dependent manner. Therefore, while XBP1s plays an important role in reactivation from latency, it inhibits later steps in lytic replication, which the virus overcomes by preventing its synthesis. Taken together, these findings suggest that KSHV hijacks UPR sensors to promote efficient viral replication while sustaining ER stress.