Objective. To characterize mesenchymal stem cells (MSCs) from human synovial membrane (SM).Methods.Cell populations were enzymatically released from the SM obtained from knee joints of adult human donors and were expanded in monolayer with serial passages at confluence.Cell clones were obtained by limiting dilution.At different passages, SM-derived cells were subjected to in vitro assays to investigate their multilineage potential.Upon treatments, phenotypes of cell cultures were analyzed by histo-and immunohistochemistry and by semiquantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction for the expression of lineagerelated marker genes.Results.SM-derived cells could be expanded extensively in monolayer, with limited senescence.Under appropriate culture conditions, SM-derived cells were induced to differentiate to the chondrocyte, osteocyte, and adipocyte lineages.Sporadic myogenesis was also observed.Five independent cell clones displayed multilineage potential.Interestingly, only 1 clone was myogenic.Donor age, cell passaging, and cryopreservation did not affect the multilineage potential of SM-derived cells.In contrast, normal dermal fibroblasts under the same culture conditions did not display this potential. Conclusion.Our study demonstrates that human multipotent MSCs can be isolated from the SM of knee joints.These cells have the ability to proliferate extensively in culture, and they maintain their multilineage differentiation potential in vitro, establishing their progenitor cell nature.SM-derived MSCs may play a role in the regenerative response during arthritic diseases and are promising candidates for developing novel cellbased therapeutic approaches for postnatal skeletal tissue repair.

We have demonstrated previously that adult human synovial membrane-derived mesenchymal stem cells (hSM-MSCs) have myogenic potential in vitro (De Bari, C., F. Dell'Accio, P. Tylzanowski, and F.P. Luyten. 2001. Arthritis Rheum. 44:1928–1942). In the present study, we have characterized their myogenic differentiation in a nude mouse model of skeletal muscle regeneration and provide proof of principle of their potential use for muscle repair in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy. When implanted into regenerating nude mouse muscle, hSM-MSCs contributed to myofibers and to long term persisting functional satellite cells. No nuclear fusion hybrids were observed between donor human cells and host mouse muscle cells. Myogenic differentiation proceeded through a molecular cascade resembling embryonic muscle development. Differentiation was sensitive to environmental cues, since hSM-MSCs injected into the bloodstream engrafted in several tissues, but acquired the muscle phenotype only within skeletal muscle. When administered into dystrophic muscles of immunosuppressed mdx mice, hSM-MSCs restored sarcolemmal expression of dystrophin, reduced central nucleation, and rescued the expression of mouse mechano growth factor.

To assess the in vitro chondrogenic potential of adult human periosteum-derived cells (PDCs) with regard to the number of cell passages and the age of the donor.Cells were enzymatically released from the periosteum of the proximal tibia obtained from adult human donors and expanded in monolayer. PDCs were harvested at multiple passages for total RNA extraction and semiquantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) gene expression analysis. For the chondrogenesis assay, cells were plated in micromass and treated with transforming growth factor beta1 (TGFbeta1) in a chemically defined medium. At different time points, micromasses were either harvested for RT-PCR analysis for cartilage and bone markers or fixed, paraffin-embedded, and stained for cartilage matrix, and immunostained for type II collagen.At the first 2 passages, human PDCs from young donors formed chondrogenic nodules. This spontaneous chondrogenic activity was lost upon passaging, and it was not observed in donors older than 30 years. Using a panel of marker genes, PDCs were shown to be phenotypically stable during cell expansion. Regardless of donor age or cell passage, chondrogenesis could be induced consistently by combining micromass culture and TGFbeta1 treatment. Histochemical and immunohistochemical analyses demonstrated the hyaline-like cartilage phenotype of the tissue generated in vitro. Other TGFbeta superfamily members, such as growth differentiation factor 5/cartilage-derived morphogenetic protein 1, and bone morphogenetic proteins 2, 4, and 7, were poorly chondrogenic under the same culture conditions.Adult human PDCs have the potential to differentiate toward the chondrocytic lineage in vitro, retaining this property even after extensive subculture. Human PDCs are easily accessible, expandable, and maintain their chondrogenic potential, and are therefore promising progenitor cells for use in the repair of joint surface defects.

Abstract Objective To investigate whether periosteal cells from adult humans have features of multipotent mesenchymal stem cells (MSCs) at the single‐cell level. Methods Cell populations were enzymatically released from the periosteum of the proximal tibia obtained from adult human donors and then expanded in monolayer. Single‐cell–derived clonal populations were obtained by limiting dilution. Culture‐expanded periosteal cell populations were tested for their growth potential and for expression of conventional markers of MSCs and were subjected to in vitro assays to investigate their multilineage potential. To assess their multipotency in vivo, periosteal cells were injected into a regenerating mouse tibialis anterior muscle for skeletal myogenesis or were either seeded into an osteoinductive matrix and implanted subcutaneously into nude mice for osteogenesis or implanted in a joint surface defect under a periosteal flap into goats for chondrogenesis. Cell phenotypes were analyzed by histochemistry and immunohistochemistry and by reverse transcription–polymerase chain reaction for the expression of lineage‐related marker genes. Results Regardless of donor age, periosteal cells were clonogenic and could be expanded extensively in monolayer, maintaining linear growth curves over at least 30 population doublings. They displayed long telomeres and expressed markers of MSCs. Under specific conditions, both parental and single‐cell–derived clonal cell populations differentiated to the chondrocyte, osteoblast, adipocyte, and skeletal myocyte lineages in vitro and in vivo. Conclusion Our study demonstrates that, regardless of donor age, the adult human periosteum contains cells that, upon enzymatic release and culture expansion, are multipotent MSCs at the single‐cell level.

We previously reported the identification in a nude mouse assay of molecular markers predictive of the capacity of articular cartilage-derived cells (ACDCs) to form ectopic stable cartilage that is resistant to vascular invasion and endochondral ossification. In the present study, we investigated whether in vitro-differentiated mesenchymal stem cells (MSCs) from the synovial membrane (SM) express the stable-chondrocyte markers and form ectopic stable cartilage in vivo.Chondrogenesis was induced in micromass culture with the addition of transforming growth factor beta1 (TGFbeta1). After acquisition of the cartilage phenotype, micromasses were implanted subcutaneously into nude mice. Alternatively, cells were released enzymatically and either replated in monolayer or injected intramuscularly into nude mice. Marker analysis was performed by quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction. Cell death was detected with TUNEL assay.Cartilage-like micromasses and released cells expressed the stable-chondrocyte markers at levels comparable with those expressed by stable ACDCs. The released cells lost chondrocyte marker expression by 24 hours in monolayer and failed to form cartilage when injected intramuscularly into nude mice. Instead, myogenic differentiation was detected. When intact TGFbeta1-treated micromasses were implanted subcutaneously, they partially lost their cartilage phenotype and underwent cell death and neoangiogenesis within 1 week. At later time points (15-40 days), we retrieved neither cartilage nor bone, and human cells were not detectable.The chondrocyte-like phenotype of human SM MSCs, induced in vitro under specific conditions, appears to be unstable and is not sufficient to obtain ectopic formation of stable cartilage in vivo. Studies in animal models of joint surface defect repair are necessary to evaluate the stability of the SM MSC chondrocyte-like phenotype within the joint environment.

Abstract Fibromyalgia is a debilitating widespread chronic pain syndrome that occurs in 2-4% of the population. The prevailing view that fibromyalgia results from central nervous system dysfunction has recently been challenged with data showing changes in peripheral nervous system activity. Using a mouse model of chronic widespread pain through hyperalgesic priming of muscle, we show that neutrophils invade sensory ganglia and confer mechanical hypersensitivity on recipient mice, whilst adoptive transfer of immunoglobulin, serum, lymphocytes or monocytes have no effect on pain behaviour. Neutrophil depletion abolishes the establishment of chronic widespread pain in mice. Neutrophils from patients with fibromyalgia also confer pain on mice. A link between neutrophil derived mediators and peripheral nerve sensitisation is already established. These observations suggest new approaches for targeting fibromyalgia pain through an understanding of the mechanisms that cause altered neutrophil activity and interactions with sensory neurons. Significance statement We used a back-translational model in mice to demonstrate the pro-nociceptive role of neutrophils in fibromyalgia. Adoptive transfer of neutrophils from mice with chronic widespread pain or from patients with fibromyalgia can confer mechanical pain to recipient naïve mice, sensitise evoked action potential firing of spinal cord neurons and produce phenotypic changes in cell surface expression of neutrophil proteins that cause infiltration of neutrophils into dorsal root ganglia. These data provide the framework for an immunological basis of chronic widespread pain in fibromyalgia mediated by polymorphonuclear granulocytes.

Background:

 We reported that intra-articular implantation of a hydrogel containing human Agrin resulted in cartilage regeneration in mice and sheep (Eldridge, 2020). In our long term study in sheep, Agrin was implanted soon after the generation of an osteochondral defect. Six months later, the animals receiving Agrin had significant bone and cartilage regeneration. What was intriguing, however, was that starting very soon after implantation, the sheep receiving Agrin were spending more time playing and less resting compared to the control animals receiving GFP as measured with accelerometers. This rapid symptomatic relief is inconsistent with the long time required for cartilage regeneration and suggested that Agrin may have a direct analgesic effect. 

Objectives:

 In this study we investigated whether Agrin has a direct analgesic effect and what is its mechanism. 

Methods:

 Osteoarthritis was induced by resecting the medial collateral ligament and the anterior horn of the medial meniscus. Acute osteochondral defects were generated surgically on the weight bearing area of the lateral femoral condyle as previously reported (Eldridge,). Pain was measured using incapacitance or von Frey filaments. Transgenic mice overexpressing human non-neuronal agrin in cartilage were generated by crossing mice expressing cre recombinase fused with the estrogen receptor driven by the Aggrecan promoters with mice expressing agrin preceded by a floxed stop codon under the control of a ubiquitous promoter. Mice overexpressing neuronal agrin in the dorsal root ganglia (DRG) were generated by crossing mice expressing cre recombinase fused to the estrogen receptor driven by the advillin promoters with mice ubiquitously expressing human neuronal agrin preceded by a floxed stop codon. DRG neurons were cultured in microfluidic chambers for functional testing. 

Results:

 Overexpression of human Agrin either within the cartilage or within the DRG 4 weeks following joint destabilization resulted in reduced pain on weightbearing in mice. The injection of femtomolar concentrations of Agrin in the knee of mice with advanced osteoarthritis or with acute pain following the generation of an osteochondral defect resulted in strong analgesia (incapacitance and von Frey filaments) as early as 2 hours after injection. In DRG cultures in microfluidic chambers, agrin reduced calcium mobilization induced by KCl. Mining a publicly available single cell RNAseq dataset (Usoskin, 2015), we identified subsets of DRG neurons expressing the agrin receptor LRP4 and characterized their phenotype. 

Conclusion:

 In addition to its previously reported chondrogenic effect, Agrin reduces pain relief in osteoarthritis and after acute osteochondral defects. Agrin has a direct inhibitory effect on DRG neurons in in vitro models of pain. 

REFERENCES:

 [1] Eldridge SE, Barawi A, Wang H, Roelofs AJ, Kaneva M, Guan Z, Lydon H, Thomas BL, Thorup A-S, Fernandez BF, et al (2020) Agrin induces long-term osteochondral regeneration by supporting repair morphogenesis. Sci Transl Med 12: eaax9086. [2] Usoskin D, Furlan A, Islam S, Abdo H, Lönnerberg P, Lou D, Hjerling-Leffler J, Haeggström J, Kharchenko O, Kharchenko PV, et al (2015) Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience 18: 145–153. 

Acknowledgements:

 We are grateful for funding the following bodies: FOREUM (1016807), Versus Arthritis (22628; 21515); MRC (MR/R000956/1). 

Disclosure of Interests:

 Suzanne Eldridge: None declared, Federico Dajas-Bailador: None declared, Victoria Chapman: None declared, Sabah Bharde: None declared, Shafaq Sikandar GSK, Daniela Cici: None declared, Francesco Dell'Accio UCB pharma and Biosplice, UCB Pharma.

Background: In Japan, more than 20 rheumatoid arthritis (RA) patients died of interstitial pneumonia (IP) caused by leflunomide (LEF) were reported, but many of them were considered as the victims of opportunistic infection currently. In this paper, efficacy and safety of low-dose LEF classified by body weight (BW) were studied. Methods: Fifty-nine RA patients were started to administrate LEF from July 2007 to July 2009. Among them, 25 patients were excluded because of the combination with tacrolimus, and medication modification within 3 months before LEF. Remaining 34 RA patients administered 20 to 50 mg/week of LEF were followed up for 1 year and enrolled in this study. Dose of LEF was classified by BW (50 mg/week for over 50 kg, 40 mg/week for 40 to 50 kg and 20 to 30 mg/week for under 40 kg). The average age and RA duration of enrolled patients were 55.5 years old and 10.2 years. Prednisolone (PSL), methotrexate (MTX) and etanercept were used in 23, 28 and 2 patients, respectively. In case of insufficient response or adverse effect, dosage change or discontinuance of LEF were considered. Failure was defined as dosages up of PSL and MTX, or dosages down or discontinuance of LEF. Last observation carried forward method was used for the evaluation of failed patients at 1 year. Results: At 1 year after LEF start, good/ moderate/ no response assessed by the European League Against Rheumatism (EULAR) response criteria using Disease Activity Score, including a 28-joint count (DAS28)-C reactive protein (CRP) were showed in 14/ 10/ 10 patients, respectively. The dosage changes of LEF at 1 year were dosage up: 10, same dosage: 5, dosage down: 8 and discontinuance: 11 patients. The survival rate of patients in this study was 23.5% (24 patients failed) but actual LEF continuous rate was 67.6% (11 patients discontinued) at 1 year. The major reason of failure was liver dysfunction, and pneumocystis pneumonia was occurred in 1 patient resulted in full recovery. One patient died of sepsis caused by decubitus ulcer infection. DAS28-CRP score was decreased from 3.9 to 2.7 significantly. Although CRP was decreased from 1.50 to 0.93 mg/dl, it wasn’t significant. Matrix metalloproteinase (MMP)-3 was decreased from 220.0 to 174.2 ng/ml significantly. Glutamate pyruvate transaminase (GPT) was increased from 19 to 35 U/l and number of leukocyte was decreased from 7832 to 6271 significantly. DAS28-CRP, CRP, and MMP-3 were improved significantly with MTX, although they weren’t without MTX. Increase of GPT and leukopenia were seen significantly with MTX, although they weren’t without MTX. Conclusions: It was reported that the risks of IP caused by LEF in Japanese RA patients were past IP history, loading dose administration and low BW. Addition of low-dose LEF is a potent safe alternative for the patients showing unsatisfactory response to current medicines, but need to pay attention for liver function and infection caused by leukopenia, especially with MTX. Disclosure statement: The authors have declared no conflicts of interest.