Cells probe their microenvironment using membrane protrusion-retraction cycles. Spatiotemporal coordination of Rac1 and RhoA GTP-binding activities initiates and reinforces protrusions and retractions, but the control of their finite lifetime remains unclear. We examined the relations of Rac1 and RhoA GTP-binding levels to key protrusion and retraction events, as well as to cell-ECM traction forces at physiologically relevant ECM stiffness. High RhoA-GTP preceded retractions and Rac1-GTP elevation before protrusions. Notable temporal Rac1-GTP nadirs and peaks occurred at the maximal edge velocity of local membrane protrusions and retractions, respectively, followed by declined edge velocity. Moreover, altered local Rac1-GTP consistently preceded similarly altered traction force. Local optogenetic Rac1-GTP perturbations defined a function of Rac1 in restricting protrusions and retractions and in promoting local traction force. Together, we show that Rac1 plays a fundamental role in restricting the size and durability of protrusions and retractions, plausibly in part through controlling traction forces.

High-content image-based cell phenotyping provides fundamental insights into a broad variety of life science disciplines. Striving for accurate conclusions and meaningful impact demands high reproducibility standards, with particular relevance for high-quality open-access data sharing and meta-analysis. However, the sources and degree of biological and technical variability, and thus the reproducibility and usefulness of meta-analysis of results from live-cell microscopy, have not been systematically investigated. Here, using high-content data describing features of cell migration and morphology, we determine the sources of variability across different scales, including between laboratories, persons, experiments, technical repeats, cells, and time points. Significant technical variability occurred between laboratories and, to lesser extent, between persons, providing low value to direct meta-analysis on the data from different laboratories. However, batch effect removal markedly improved the possibility to combine image-based datasets of perturbation experiments. Thus, reproducible quantitative high-content cell image analysis of perturbation effects and meta-analysis depend on standardized procedures combined with batch correction.

Abstract High-content image-based cell phenotyping provides fundamental insights in a broad variety of life science areas. Striving for accurate conclusions and meaningful impact demands high reproducibility standards, even more importantly with the advent of data sharing initiatives. However, the sources and degree of biological and technical variability, and thus the reproducibility and usefulness of meta-analysis of results from live-cell microscopy have not been systematically investigated. Here, using high content data describing features of cell migration and morphology, we determine the sources of variability across different scales, including between laboratories, persons, experiments, technical repeats, cells and time points. Significant technical variability occurred between laboratories, providing low value to direct meta-analysis on the data from different laboratories. However, batch effect removal markedly improved the possibility to combine image-based datasets of perturbation experiments. Thus, reproducible quantitative high-content cell image data and meta-analysis depend on standardized procedures and batch correction applied to studies of perturbation effects.

Adhesion to the extracellular matrix (ECM) persists during mitosis in most cell types. Yet, classical adhesion complexes (ACs), such as focal adhesions and focal complexes, do and must disassemble to enable cytoskeletal rearrangements associated with mitotic rounding. Given this paradox, mechanisms of mitotic cell-ECM adhesion remain undefined. Here, we identify "reticular adhesions", a new class of AC that is mediated by integrin avb5, formed during interphase and preserved at cell-ECM attachment sites throughout cell division. Consistent with this role, integrin b5 depletion perturbs mitosis and disrupts spatial memory transmission between cell generations. Quantitative imaging reveals reticular adhesions to be both morphologically and dynamically distinct from classic focal adhesions, while mass spectrometry defines their unique composition; lacking virtually all consensus adhesome components. Indeed, remarkably, reticular adhesions are functionally independent of both talin and F-actin, yet are promoted by phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PI-4,5-P2). Overall, the distinct characteristics of reticular adhesions provide a unique solution to the problem of maintaining cell-ECM attachment during mitotic rounding and division.

Abstract The endoribonuclease (EndoU) nsp15 of coronaviruses plays an important role in evasion of host innate immune responses by reducing the abundance of viral double-stranded RNA, whereas less is known about potential host cellular targets of nsp15. In this study, we show that cellular protein synthesis is inhibited upon over-expression of nsp15 from four genera of coronaviruses and this is accompanied by nuclear retention of the poly(A) binding protein cytoplasmic 1 (PABPC1). We also show that the EndoU activity of nsp15 is indispensable for both, inhibition of protein synthesis and PABPC1 nuclear relocation. FISH analysis using oligo-dT probes, revealed an overlap between the localization of cellular mRNA and that of overexpressed nsp15 in some cells, suggesting that, when expressed alone, nsp15 may target host mRNA. When investigating the association of nsp15 on protein shut off in the context of a viral infection, we observed that the γ -coronavirus infectious bronchitis virus (IBV), induced host translation shutoff in an p-eIF2α-independent manner and mainly retained PABPC1 in the cytoplasm, whereas the nsp15 EndoU-deficient IBV accumulated viral dsRNA and caused p-PKR-p-eIF2α-dependent host protein translation shutoff, accompanied with PABPC1 nuclear relocation or stress granule (SG) localization. This phenomenon suggests that during infection with wild type IBV, although the cellular translation is inhibited, initiation of viral mRNA translation leads to PABPC1 binding to viral mRNA, thereby preventing its nuclear entry; during infection with nsp15 EndoU-deficient IBV however, the eIF2α-dependent host protein translation shutoff prevents both host and viral mRNA translation initiation, releasing PABPC1 from binding to cytosolic and viral mRNA, thereby relocating it to the nucleus or to SG. Altogether, this study reveals unique yet conserved mechanisms of host protein shutoff that add to our understanding of how coronaviruses regulate host protein expression through a mechanism that involves catalytically active nsp15 EndoU, and describes how nsp15 may target both, viral and host mRNA. Author summary It has been reported that coronavirus infection suppresses host protein translation, α- and β- coronavirus nsp1 is responsible for inhibition of host gene expression. However, for γ- and δ -coronavirus, there is no nsp1 and the underlying mechanisms by which virus regulates host translation are not well characterized. Here, we show that coronavirus endoribonuclease nsp15 is responsible for the inhibition of host translation by targeting to host factors, meanwhile it helps virus bypass the PKR-eIF2α mediated host translation shutoff, which is harmful for virus gene expression, by reducing the accumulation of viral dsRNA. This novel finding gives insight how does nsp15 targets to both host factors and viral RNA, to facilitate virus replication. Moreover, the novel function of nsp15 is found to be conserved among coronaviruses, revealing the essential role of this endoribonuclease in hijacking host translation machinery for virus replication.

Abstract Cytoplasmic stress granules (SGs) are generally triggered by stress-induced translation arrest for storing mRNAs. Recently, it has been shown that SGs exert anti-viral functions due to their involvement in protein synthesis shut off and recruitment of innate immune signaling intermediates. The largest RNA virus, coronavirus, mutates frequently and circulates among animals, imposing great threat to public safety and animal health; however, the significance of SGs in coronavirus infections is largely unknown. Infectious bronchitis virus (IBV) is the first identified coronavirus in 1930s and has been prevalent in poultry farm for many years. In this study, we provide evidence that IBV overcomes the host antiviral response by inhibiting SGs formation via the virus-encoded endoribonuclease nsp15. By immunofluorescence analysis, we observed that IBV infection not only did not trigger SGs formation in approximately 80% of the infected cells, but also impaired the formation of SGs triggered by heat shock, sodium arsenite, or NaCl stimuli. We show that the intrinsic endoribonuclease activity of nsp15 is responsible for the inhibition of SGs formation. In fact, nsp15-defective recombinant IBV (rIBV-nsp15-H238A) greatly induced the formation of SGs, along with accumulation of dsRNA and activation of PKR, whereas wild type IBV failed to do so. Consequently, infection with rIBV-nsp15-H238A triggered transcription of IFN-β which in turn greatly affected recombinant virus replication. Further analysis showed that SGs function as antiviral hub, as demonstrated by the attenuated IRF3-IFN response and increased production of IBV in SG-defective cells. Additional evidence includes the aggregation of PRRs and signaling intermediates to the IBV-induced SGs. Collectively, our data demonstrate that the endoribonuclease nsp15 of IBV suppresses the formation of antiviral hub SGs by regulating the accumulation of viral dsRNA and by antagonizing the activation of PKR, eventually ensuring productive virus replication. We speculate that coronaviruses employ similar mechanisms to antagonize the host anti-viral SGs formation for efficient virus replication, as the endoribonuclease function of nsp15 is conserved in all coronaviruses. Author summary It has been reported that stress granules (SGs) are part of the host cell antiviral response. Not surprisingly, viruses in turn produce an array of antagonists to counteract such host response. Here, we show that IBV inhibits the formation of SGs through its endoribonuclease nsp15, by reducing the accumulation of viral dsRNA, evading the activation of PKR, and by subsequently inhibiting eIF2α phosphorylation and SGs formation. Nsp15 also inhibits SG formation independent of the eIF2α pathway, probably by targeting host mRNA. Depletion of SG scaffold proteins decreases IRF3-IFN response and increases the production of IBV. All coronaviruses encode a conserved endoribonuclease nsp15, and it will be important to determine whether also other (non-avian) coronaviruses limit the formation of anti-viral SGs in a similar manner.

Abstract Spatiotemporal coordination of the GTP-binding activity of Rac1 and RhoA initiates and reinforces cell membrane protrusions and retractions during cell migration 1–7 . However, while protrusions and retractions form cycles that cells use to efficiently probe their microenvironment 8–10 , the control of their finite lifetime remains unclear. To examine if Rac1 or RhoA may also control protrusion and retraction lifetimes, we here define the relation of their spatiotemporal GTP-binding levels to key protrusion and retraction events, as well as to cell-ECM mechanical forces in fibrosarcoma cells grown on collagen of physiologically relevant stiffness. We identified temporal Rac1-GTP nadirs and peaks at the maximal edge velocity of local membrane protrusions and retractions, respectively, followed by declined edge velocity. Moreover, increased local Rac1-GTP consistently preceded increased cell-ECM traction force. This suggests that Rac1-GTP nadirs and peaks may restrain the lifetime of protrusions and retractions, possibly involving the regulation of local traction forces. Functional testing by optogenetics validated this notion, since local Rac1-GTP elevation applied early in the process prolonged protrusions and restrained retractions, while local Rac1-GTP inhibition acted in reverse. Optogenetics also defined Rac1-GTP as a promotor of local traction force. Together, we show that Rac1 plays a fundamental role in restricting the size and durability of protrusions and retractions, plausibly in part through controlling traction forces.