ABSTRACT C 4 grasses often outperform C 3 species under hot, arid conditions due to superior water and nitrogen use efficiencies and lower rates of photorespiration. A method of concentrating CO 2 around the site of carbon fixation in the bundle sheath (BS) is required to realize these gains. In NADP-malic enzyme (NADP-ME)-type C 4 grasses such as maize, suberin deposition in the BS cell wall is hypothesized to act as a diffusion barrier to CO 2 escape and O 2 entry from surrounding mesophyll cells. Suberin is a heteropolyester comprised of acyl-lipid-derived aliphatic and phenylpropanoid-derived aromatic components. To disrupt BS suberization, we mutated two paralogously duplicated, unlinked maize orthologues of Arabidopsis thaliana ALIPHATIC SUBERIN FERULOYL TRANSFERASE, ZmAsft1 and ZmAsft2 , using closely linked Dissociation transposons. Loss-of-function double mutants revealed a 97% reduction in suberin-specific omega-hydroxy fatty acids without a stoichiometric decrease in ferulic acid. However, BS suberin lamellae were deficient in electron opaque material, and cohesion between the suberin lamellae and polysaccharide cell walls was attenuated in double mutants. There were no other morphological phenotypes under ambient conditions. Furthermore, there was no significant effect on net CO 2 assimilation at any intercellular CO 2 concentration, and no effect on 13 C isotope discrimination relative to wild type. Thus, ZmAsft expression is not required to establish a functional CO 2 concentrating mechanism in in maize. Double mutant leaves exhibit elevated cell wall elasticity, transpirational, and stomatal conductance relative to WT. Thus, the ZmAsft genes are dispensable for gas exchange barrier function but may be involved in regulation of leaf water movement. One-sentence Summary Double mutants of two paralogously duplicated maize Aliphatic Suberin Feruloyl Transferase (ZmAsft) genes exhibit reduced aliphatic suberin content, cell wall cohesion defects, and elevated leaf transpiration, but no changes in CO2 assimilation relative to wild type.

Genetic selection for whole plant water use efficiency (yield per transpiration; WUEplant) in any crop-breeding program requires high throughput phenotyping of component traits of WUEplant such as transpiration efficiency (TEi; CO2 assimilation rate per stomatal conductance). Leaf carbon stable isotope composition ( δ13Cleaf) has been suggested as a potential proxy for WUEplant because both parameters are influenced by TEi. However, a genetic link between δ13Cleaf and WUEplant in a C4 species is still not well understood. Therefore, a high throughput phenotyping facility was used to measure WUEplant in a recombinant inbred line (RIL) population of the C4 grasses Setaria viridis and S. italica to determine the genetic relationship between δ13Cleaf, WUEplant, and TEi under well-watered and water-limited growth conditions. Three quantitative trait loci (QTL) for δ13Cleaf were found to co-localize with transpiration, biomass accumulation, and WUEplant. WUEplant calculated for each of the three δ13Cleaf allele classes was negatively correlated with δ13Cleaf as would be predicted when TEi is driving WUEplant. These results demonstrate that δ13Cleaf is genetically linked to WUEplant through TEi and can be used as a high throughput proxy to screen for WUEplant in these C4 species.

Plant growth and water use are interrelated processes influenced by the genetic control of both plant morphological and biochemical characteristics. Improving plant water use efficiency (WUE) to sustain growth in different environments is an important breeding objective that can improve crop yields and enhance agricultural sustainability. However, genetic improvements of WUE using traditional methods have proven difficult due to low throughput and environmental heterogeneity encountered in field settings. To overcome these limitations the study presented here utilizes a high-throughput phenotyping platform to quantify plant size and water use of an interspecific Setaria italica x Setaria viridis recombinant inbred line population at daily intervals in both well-watered and water-limited conditions. Our findings indicate that measurements of plant size and water use in this system are strongly correlated; therefore, a linear modeling approach was used to partition this relationship into predicted values of plant size given water use and deviations from this relationship at the genotype level. The resulting traits describing plant size, water use and WUE were all heritable and responsive to soil water availability, allowing for a genetic dissection of the components of plant WUE under different watering treatments. Linkage mapping identified major loci underlying two different pleiotropic components of WUE. This study indicates that alleles controlling WUE derived from both wild and domesticated accessions of the model C4 species Setaria can be utilized to predictably modulate trait values given a specified precipitation regime.