Abstract Colorectal cancer (CRC) is the second-deadliest cancer in the world, yet a deeper understanding of spatial patterns of gene expression in the tumor microenvironment (TME) remains elusive. Here, we introduce the Visium HD platform (10x Genomics) and use it to investigate human CRC and normal adjacent mucosal tissues from formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples. The first assay available on Visium HD is a probe-based spatial transcriptomics workflow that was developed to enable whole transcriptome single cell scale analysis. We demonstrate highly refined unsupervised spatial clustering in Visium HD data that aligns with the hallmarks of colon tissue morphology and is notably improved over earlier Visium assays. Using serial sections from the same FFPE blocks we generate a single cell atlas of our samples, then we integrate the data to comprehensively characterize the immune cell types present in the TME, specifically at the tumor periphery. We observed enrichment of two pro-tumor macrophage subpopulations with differential gene expression profiles that were localized within distinct tumor regions. Further characterization of the T cells present in one of the samples revealed a clonal expansion that we were able to localize in the tissue using in situ gene expression analysis. In situ analysis also allowed us to perform in-depth characterization of the microenvironment of the clonally expanded T cell population and we identified a third macrophage subpopulation with gene expression profiles consistent with an anti-tumor response. Our study provides a comprehensive map of the cellular composition of the CRC TME and identifies phenotypically and spatially distinct immune cell populations within it. We show that the single cell-scale resolution afforded by Visium HD and the whole transcriptome nature of the assay allows investigations into cellular function and interaction at the tumor periphery in FFPE tissues, which has not been previously possible.

Abstract Motivation The major algorithms for quantifying transcriptomics data for differential gene expression analysis were designed for analyzing data from human or human-like genomes, specifically those with single gene transcripts and distinct transcriptional boundaries that extend beyond the coding sequence (CDS) as identified through expressed sequence tags (ESTs) or EST-like sequence data. Some eukaryotic genomes and all, or nearly all, bacterial genomes require alternate methods of quantification since they lack annotation of transcriptional boundaries with EST or EST-like data, have overlapping transcriptional boundaries, and/or have polycistronic transcripts. Results An algorithm was developed and tested that better quantifies transcriptomics data for differential gene expression analysis in organisms with overlapping transcriptional units and polycistronic transcripts. Using data from standard libraries originating from Escherichia coli and Ehrlichia chaffeensis, and strand-specific libraries from the Wolbachia endosymbiont wBm, FADU can derive counts for genes that are missed by HTSeq and featurecounts. Using the default parameters with the E. coli data, FADU can detect transcription of 51 more genes than HTSeq in union mode and 21 genes more than featurecounts, with 42 and 18 of these features being <300 bp, respectively. Due to its ability to derive counts for otherwise unrepresented genes without overstating their abundance, we believe FADU to be an improved tool for quantifying transcripts in prokaryotic systems for RNA-Seq analyses. Availability and implementation FADU is available at https://github.com/adkinsrs/FADU . FADU was implemented using Python3 and requires the PySAM module (version 0.12.0.1 or later). Contact jdhotopp@som.umaryland.edu

Abstract Several important human infectious diseases are caused by microscale-sized parasitic nematodes like filarial worms. Filarial worms have their own spatial tissue organization and to uncover this tissue structure, we need methods that can spatially resolve these miniature specimens. Most filarial worms evolved a mutualistic association with endosymbiotic bacteria Wolbachia , however, the mechanisms underlying the dependency of filarial worms on the fitness of these bacteria remain unknown. As Wolbachia is essential for the development, reproduction, and survival of filarial worms, we focused on studying a posterior region containing reproductive tissue and developing embryos of adult female Brugia malayi worms. To spatially explore how Wolbachia interacts with the worm’s reproductive system, we performed a spatial characterization using Spatial Transcriptomics (ST) across our region of interest. We provide a proof-of-concept for miniature-ST to explore spatial gene expression patterns in small sample types, demonstrating the method’s ability to uncover nuanced tissue region expression patterns, observe the spatial localization of key B. malayi - Wolbachia pathway genes, and co-localize the B. malayi spatial transcriptome in Wolbachia tissue regions. We envision our approach to open up new scenarios for the study of infectious diseases caused by micro-scale parasitic worms.

ABSTRACT Air particulate matter (PM) is widely recognized for its potential to negatively affect human health, including changes in the upper respiratory microbiome. However, research on PM-associated microbiota remains limited and mostly focused on PM (e.g., PM 2.5 and PM 10 ). This study aims to characterize for the first time the microbiome of Total Suspended Particles (TSP) and investigate the correlations of indoor TSP with the human upper respiratory microbiome. Biological and environmental samples were collected over three collection periods lasting three weeks each, between May and July 2022 at the University of Milan and the University of Insubria Como. TSP were sampled using a filter-based technique, while respiratory samples from both anterior nares (AN) and the nasopharynx (NP) were collected using swabs. Microbiome analysis of both human (N = 145) and TSP (N = 51) samples was conducted on metagenomic sequencing data. A comparison of indoor and outdoor TSP microbiomes revealed differences in microbial diversity and taxonomic composition. The indoor samples had higher relative abundance of environmental bacteria often associated with opportunistic infections like Paracoccus sp., as well as respiratory bacteria such as Staphylococcus aureus and Klebsiella pneumoniae . Additionally, both indoor and outdoor TSP samples contained broad spectrum antibiotic resistance genes. Indoor TSP exposure was negatively associated with commensal bacteria and positively associated with Staphylococcus aureus relative abundance. Finally, a correlation between the relative abundance of respiratory bacteria identified in the indoor TSP and the upper respiratory microbiome was found, suggesting a potential interaction between TSP and the upper airways.

With the exponential increase in the number of bacterial taxa with genome sequence data, a new standardized method is needed to assign bacterial species designations using genomic data that is consistent with the classically-obtained taxonomy. This is particularly acute for unculturable obligate intracellular bacteria like those in the Rickettsiales, where classical methods like DNA-DNA hybridization cannot be used to define species. Within the Rickettsiales, species designations have been applied inconsistently, often obfuscating the relationship between organisms and the context for experimental results. In this study, we generated core genome alignments for a wide range of genera with classically defined species, including Arcobacter, Caulobacter, Erwinia, Neisseria, Polaribacter, Ralstonia, Thermus, as well as genera within the Rickettsiales including Rickettsia, Orientia, Ehrlichia, Neoehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia, and Wolbachia. A core genome alignment sequence identity (CGASI) threshold of 96.8% was found to maximize the prediction of classically-defined species. Using the CGASI cutoff, the Wolbachia genus can be delineated into species that differ from the currently used supergroup designations, while the Rickettsia genus is delineated into nine species, as opposed to the current 27 species. Additionally, we find that core genome alignments cannot be constructed between genomes belonging to different genera, establishing a bacterial genus cutoff that suggests the need to create new genera from the Anaplasma and Neorickettsia. By using core genome alignments to assign taxonomic designations, we aim to provide a high-resolution, robust method for bacterial nomenclature that is aligned with classically-obtained results.

Enrichment methodologies enable analysis of minor members in multi-species transcriptomic analyses. We compared standard enrichment of bacterial and eukaryotic mRNA to targeted enrichment with Agilent SureSelect (AgSS) capture for Brugia malayi, Aspergillus fumigatus, and the Wolbachia endosymbiont of B. malayi (wBm). Without introducing significant systematic bias, the AgSS quantitatively enriched samples, resulting in more reads mapping to the target organism. The AgSS-enriched libraries consistently had a positive linear correlation with its unenriched counterpart (r2=0.559-0.867). Up to a 2,242-fold enrichment of RNA from the target organism was obtained following a power law (r2=0.90), with the greatest fold enrichment achieved in samples with the largest ratio difference between the major and minor members. While using a single total library for prokaryote and eukaryote in a single sample could be beneficial for samples where RNA is limiting, we observed a decrease in reads mapping to protein coding genes and an increase of multi-mapping reads to rRNAs in AgSS enrichments from eukaryotic total RNA libraries as opposed to eukaryotic poly(A)-enriched libraries. Our results support a recommendation of using Agilent SureSelect targeted enrichment on poly(A)-enriched libraries for eukaryotic captures and total RNA libraries for prokaryotic captures to increase the robustness of multi-species transcriptomic studies.