Summary Small nuclear RNAs (snRNAs) are core spliceosome components and mediate pre-mRNA splicing. During their biogenesis, snRNAs acquire several constitutive nucleotide modifications. Here we show that snRNAs also contain a regulated and reversible nucleotide modification causing them to exist as two different methyl isoforms, m 1 and m 2 , reflecting the methylation state of the adenosine adjacent to the snRNA cap. We find that snRNA biogenesis involves the formation of an initial m 1 -isoform with a single-methylated adenosine (2’- O -methyladenosine, Am), which is then converted to a dimethylated m 2 -isoform ( N 6 ,2’- O -dimethyladenosine, m 6 Am). The relative m 1 - and m 2 -isoform levels are determined by the RNA demethylase FTO, which selectively demethylates the m 2 -isoform. We show FTO is inhibited by endogenous metabolites, resulting in increased m 2 -snRNA levels. Furthermore, cells that exhibit high m 2 -snRNA levels show altered patterns of alternative splicing. Together, these data reveal that FTO has a central role in snRNA biogenesis and controls a previously unknown step of snRNA processing involving reversible methylation, thereby providing a potential link between reversible RNA modifications and mRNA splicing.

KRAS is the most frequently mutated oncogene in human lung adenocarcinomas (hLUAD) and activating mutations in KRAS frequently co-occur with loss-of-function mutations in the tumor suppressor genes, TP53 or STK11/LKB1 . However, mutation of all three genes is rarely observed in hLUAD, even though engineered mutations of all three genes produces a highly aggressive lung adenocarcinoma in mice (mLUAD). Here we provide an explanation of this difference between hLUAD and mLUAD by uncovering an evolutionary divergence in regulation of the glycolytic enzyme triosephosphate isomerase (TPI1). Using KRAS/TP53 mutant hLUAD cell lines, we show that TPI1 enzymatic activity can be altered via phosphorylation at Ser21 by the Salt Inducible Kinases (SIKs) in an LKB1-dependent manner; this allows modulation of glycolytic flux between completion of glycolysis and production of glycerol lipids. This metabolic flexibility appears to be critical in rapidly growing cells with KRAS and TP53 mutations, explaining why loss of LKB1 creates a metabolic liability in these tumors. In mice, the amino acid at position 21 of TPI1 is a Cys residue which can be oxidized to alter TPI1 activity, allowing regulation of glycolytic flux balance without a need for SIK kinases or LKB1. Our findings reveal an unexpected role for TPI1 in metabolic reprogramming and suggest that LKB1 and SIK family kinases are potential targets for treating KRAS/TP53 mutant hLUAD. Our data also provide a cautionary example of the limits of genetically engineered murine models as tools to study human diseases such as cancers.

N1-methyladenosine (m1A) was recently identified as a new mRNA modification based on its mapping to the 5’ UTRs of thousands of mRNAs with an m1A-binding antibody. More recent studies have confirmed the prevalence of m1A, while others have questioned it. To address this discrepancy, we mapped m1A using ultra-deep RNA-Seq datasets based on m1A-induced misincorporations during reverse transcription. Using this approach, we find m1A only in the mitochondrial MT-ND5 transcript. In contrast, when we mapped m1A antibody-binding sites at single-nucleotide resolution, we found binding to transcription start nucleotides in mRNA 5’ UTRs. Using different biochemical assays, we find that m1A is not present at these sites. Instead, we find that the m1A antibody exhibits m1A-independent binding to mRNA cap structures. We also tested a new and independently derived m1A antibody. We show that this m1A antibody lacks m7G cap-binding cross-reactivity, and notably does not map to 5’ UTRs in the transcriptome. Our data demonstrate that high-stoichiometry m1A sites are rare in the transcriptome and that previous mapping of m1A to mRNA 5’ UTRs are due to unintended binding of the m1A antibody to m7G cap structure in mRNA.