Sodium azide inhibits bacterial growth by inhibiting the activity of SecA, an ATPase required for translocation of proteins across the cytoplasmic membrane. To investigate the mechanism of action of azide, we used transposon directed insertion-site sequencing (TraDIS) to screen a high-density library of transposon insertion mutants for mutations that affect the susceptibility of E. coli to azide. Insertions in genes encoding most components of the Sec machinery increased susceptibility to azide. However, insertions truncating the C-terminal extension (CTE) of SecA decreased susceptibility of E. coli to azide. Insertions in genes encoding many metal binding proteins also increased susceptibility to azide, and transcriptional profiling suggested that treatment with azide disrupted iron homeostasis. The presence of iron in the media decreased the susceptibility of E. coli to azide, and mutations in the secA gene that confer resistance to azide altered the response of E. coli to iron limitation, suggesting a connection between iron metabolism and protein translocation. Although previous work suggests that SecA binds to zinc, SecA copurified with iron when expressed at physiological levels, and azide disrupted the interaction of the C-terminal metal-binding domain (MeBD) with iron in vivo. Biophysical analysis of metal binding by the MeBD using isothermal titration calorimetry and 1H-nuclear magnetic resonance indicated a clear binding preference for Fe2+ over Zn2+. These results indicate that the physiological ligand of SecA is iron and that azide inhibits SecA by disrupting iron binding. Importance: Sodium azide is a common preservative that inhibits bacterial growth by inhibiting SecA, an ATPase that is required for transporting proteins across the cytoplasmic membrane. Previous studies have suggested that azide inhibits the ATPase activity SecA by slowing the rate of nucleotide exchange. However, our results suggest that azide inhibits SecA by disrupting the structure of the C-terminal MeBD. It is thought that this domain binds to Zn2+. However, our results indicate that the MeBD normally binds to Fe2+ and that azide disrupts the interaction of the MeBD with Fe2+. Furthermore, mutations in the secA gene that confer azide resistance also cause a defect in the response of E. coli to iron depletion. SecA-dependent protein translocation is generally thought to be unregulated. However, these results suggest that the activity of SecA could be regulated in response to iron limitation.

The ATPase SecA is an essential component of the bacterial Sec machinery, which transports proteins across the cytoplasmic membrane. Most SecA proteins contain a long C-terminal tail (CTT). In Escherichia coli , the CTT contains a structurally flexible linker domain and a small metal-binding domain (MBD). The MBD coordinates zinc via a conserved cysteine-containing motif and binds to SecB and ribosomes. In this study, we screened a high-density transposon library for mutants that affect the susceptibility of E. coli to sodium azide, which inhibits SecA-mediated translocation. Results from sequencing this library suggested that mutations removing the CTT make E. coli less susceptible to sodium azide at subinhibitory concentrations. Copurification experiments suggested that the MBD binds to iron and that azide disrupts iron binding. Azide also disrupted binding of SecA to membranes. Two other E. coli proteins that contain SecA-like MBDs, YecA and YchJ, also copurified with iron, and NMR spectroscopy experiments indicated that YecA binds iron via its MBD. Competition experiments and equilibrium binding measurements indicated that the SecA MBD binds preferentially to iron and that a conserved serine is required for this specificity. Finally, structural modelling suggested a plausible model for the octahedral coordination of iron. Taken together, our results suggest that SecA-like MBDs likely bind to iron in vivo .* BEST : band-selective short transient excitation DIPSI : decoupling in the presence of scalar interactions DTT : dithiothreitol EDTA : ethylene diamine tetra-acetic acid EPR : electron paramagnetic resonance HSQC : heteronuclear single quantum coherence ICP : inductively coupled plasma IPTG : isopropyl-β-thiogalactoside ITC : isothermal titration calorimetry MS : mass spectrometry NMR : nuclear magnetic resonance NTA : nitrilotriacetic acid OES : optical emission spectrometry SUMO : small ubiquitin-like modifier TCEP : tris(2-carboxyethyl)phosphine TOCSY : total correlated spectroscopy TROSY : transverse relaxation optimised spectroscopy UPF : unidentified protein function UV : ultraviolet

In specialised cells, the expression of specific tubulin isoforms and their subsequent post-translational modifications drive and coordinate unique morphologies and behaviours. The mechanisms by which β 1 tubulin, the platelet and megakaryocyte (MK) lineage restricted tubulin isoform, drives platelet production and function remains poorly understood. We investigated the roles of two key post-translational polymodifications (polyglutamylation and polyglycylation) on these processes using a cohort of thrombocytopenic patients, human induced pluripotent stem cell (iPSC) derived MKs, and healthy human donor platelets. We find distinct patterns of polymodification in MKs and platelets, mediated by the antagonistic activities of the cell specific expression of Tubulin Tyrosine Ligase Like (TTLLs) and Cytosolic Carboxypeptidae (CCP) enzymes. The resulting microtubule patterning spatially regulates motor proteins to drive proplatelet formation in megakaryocytes, and the cytoskeletal reorganisation required for thrombus formation. This work is the first to show a reversible system of polymodification by which different cell specific functions are achieved.Key Points ### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

The use of CRISPR-Cas9 genome editing to introduce endogenously expressed tags has the potential to address a number of the classical limitations of single molecule localisation microscopy. In this work we present the first systematic comparison of inserts introduced through CRISPR- knock in, with the aim of optimising this approach for single molecule imaging. We show that more highly monomeric and codon optimised variants of mEos result in improved expression at the TubA1B locus, despite the use of identical guides, homology templates, and selection strategies. We apply this approach to target the G protein-coupled receptor (GPCR) CXCR4 and show a further insert dependent effect on expression and protein function. Finally, we show that compared to over-expressed CXCR4, endogenously labelled samples allow for accurate single molecule quantification on ligand treatment. This suggests that despite the complications evident in CRISPR mediated labelling, the development of CRISPR-PALM has substantial quantitative benefits.