Humoral hypercalcemia of malignancy is a common complication of lung and certain other cancers. The hypercalcemia results from the actions of tumor factors on bone and kidney. We report here the isolation of full-length complementary DNA clones of a putative hypercalcemia factor, and the expression from the cloned DNA of the active protein in mammalian cells. The clones encode a prepro peptide of 36 amino acids and a mature protein of 141 amino acids that has significant homology with parathyroid hormone in the amino-terminal region. This previously unrecognized hormone may be important in normal as well as abnormal calcium metabolism.

The regulatory domain of protein kinase C contains an amino acid sequence between residues 19 and 36 that resembles a substrate phosphorylation site in its distribution of basic residue recognition determinants. The corresponding synthetic peptide (Arg 19 -Phe-Ala-Arg-Lys-Gly- Ala 25 -Leu-Arg-Gln-Lys-Asn-Val-His-Glu-Val-Lys-Asn 36 ) acts as a potent substrate antagonist with an inhibitory constant of 147 ± 9 n M . It is a specific inhibitor of protein kinase C and inhibits both autophosphorylation and protein substrate phosphorylation. Substitution of Ala 25 with serine transforms the pseudosubstrate into a potent substrate. These results demonstrate that the conserved region of the regulatory domain (residues 19 to 36) of protein kinase C has the secondary structural features of a pseudosubstrate and may be responsible for maintaining the enzyme in the inactive form in the absence of allosteric activators such as phospholipids.

The AMP-activated protein kinase (AMPK) is an important regulator of cellular metabolism in response to metabolic stress and to other regulatory signals. AMPK activity is absolutely dependent upon phosphorylation of AMPKαThr-172 in its activation loop by one or more AMPK kinases (AMPKKs). The tumor suppressor kinase, LKB1, is a major AMPKK present in a variety of tissues and cells, but several lines of evidence point to the existence of other AMPKKs. We have employed three cell lines deficient in LKB1 to study AMPK regulation and phosphorylation, HeLa, A549, and murine embryo fibroblasts derived from LKB-/- mice. In HeLa and A549 cells, mannitol, 2-deoxyglucose, and ionomycin, but not 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-d-ribofuranoside (AICAR), treatment activates AMPK by αThr-172 phosphorylation. These responses, as well as the downstream effects of AMPK on the phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase,arelargelyinhibitedbytheCa2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase (CaMKK) inhibitor, STO-609. AMPKK activity in HeLa cell lysates measured in vitro is totally inhibited by STO-609 with an IC50 comparable with that of the known CaMKK isoforms, CaMKKα and CaMKKβ. Furthermore, 2-deoxyglucose- and ionomycin-stimulated AMPK activity, αThr-172 phosphorylation, and acetyl-CoA carboxylase phosphorylation are substantially reduced in HeLa cells transfected with small interfering RNAs specific for CaMKKα and CaMKKβ. Lastly, the activation of AMPK in response to ionomycin and 2-deoxyglucose is not impaired in LKB1-/- murine embryo fibroblasts. These data indicate that the CaMKKs function in intact cells as AMPKKs, predicting wider roles for these kinases in regulating AMPK activity in vivo. The AMP-activated protein kinase (AMPK) is an important regulator of cellular metabolism in response to metabolic stress and to other regulatory signals. AMPK activity is absolutely dependent upon phosphorylation of AMPKαThr-172 in its activation loop by one or more AMPK kinases (AMPKKs). The tumor suppressor kinase, LKB1, is a major AMPKK present in a variety of tissues and cells, but several lines of evidence point to the existence of other AMPKKs. We have employed three cell lines deficient in LKB1 to study AMPK regulation and phosphorylation, HeLa, A549, and murine embryo fibroblasts derived from LKB-/- mice. In HeLa and A549 cells, mannitol, 2-deoxyglucose, and ionomycin, but not 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-d-ribofuranoside (AICAR), treatment activates AMPK by αThr-172 phosphorylation. These responses, as well as the downstream effects of AMPK on the phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase,arelargelyinhibitedbytheCa2+/calmodulin-dependent protein kinase kinase (CaMKK) inhibitor, STO-609. AMPKK activity in HeLa cell lysates measured in vitro is totally inhibited by STO-609 with an IC50 comparable with that of the known CaMKK isoforms, CaMKKα and CaMKKβ. Furthermore, 2-deoxyglucose- and ionomycin-stimulated AMPK activity, αThr-172 phosphorylation, and acetyl-CoA carboxylase phosphorylation are substantially reduced in HeLa cells transfected with small interfering RNAs specific for CaMKKα and CaMKKβ. Lastly, the activation of AMPK in response to ionomycin and 2-deoxyglucose is not impaired in LKB1-/- murine embryo fibroblasts. These data indicate that the CaMKKs function in intact cells as AMPKKs, predicting wider roles for these kinases in regulating AMPK activity in vivo. The AMP-activated protein kinase (AMPK) 1The abbreviations used are: AMPK, AMP-activated protein kinase; AMPKK, AMPK kinase; MEF, mouse embryo fibroblast; ACC, acetyl-CoA carboxylase; CaM, calmodulin; CaMKK, CaM-dependent protein kinase kinase; siRNA, small interfering RNA; HRP, horseradish peroxidase; ANOVA, analysis of variance; 2-DG, 2-deoxyglucose; MAP, mitogen-activated protein; AICAR, 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-d-ribofuranoside. regulates many aspects of cellular metabolism, especially in response to metabolic stress (1Hardie D.G. Scott J.W. Pan D.A. Hudson E.R. FEBS Lett. 2003; 546: 113-120Crossref PubMed Scopus (729) Google Scholar). AMPK is a serine/threonine protein kinase and a member of the Snf1/AMPK protein kinase family (1Hardie D.G. Scott J.W. Pan D.A. Hudson E.R. FEBS Lett. 2003; 546: 113-120Crossref PubMed Scopus (729) Google Scholar). It is an αβγ heterotrimeric protein, consisting of an α catalytic subunit, a β subunit important both for enzyme activity and for targeting, and a γ regulatory subunit, which binds the allosteric activator, AMP. The activity of AMPK absolutely requires phosphorylation of the α subunit on Thr-172 in its activation loop by one or more upstream kinases (AMPKK) (1Hardie D.G. Scott J.W. Pan D.A. Hudson E.R. FEBS Lett. 2003; 546: 113-120Crossref PubMed Scopus (729) Google Scholar). The major breakthrough in identifying AMPK upstream kinases came from the study of the regulation of the AMPK ortholog, Snf1, in Saccharomyces cerevisiae, in which Pak1 was shown to act as a Snf1p kinase kinase (2Nath N. McCartney R.R. Schmidt M.C. Mol. Cell. Biol. 2003; 23: 3909-3917Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar). Subsequently, it was shown that three closely related kinases, Pak1p, Tos3p, and Elm1p, needed to be deleted to generate the Snf1- phenotype (3Hong S.P. Leiper F.C. Woods A. Carling D. Carlson M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 8839-8843Crossref PubMed Scopus (487) Google Scholar, 4Sutherland C.M. Hawley S.A. McCartney R.R. Leech A. Stark M.J. Schmidt M.C. Hardie D.G. Curr. Biol. 2003; 13: 1299-1305Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (225) Google Scholar). Sequence comparison revealed that the human LKB1 tumor suppressor kinase was the most closely related mammalian kinase. LKB1 was subsequently identified by several groups as being an important upstream kinase active on AMPK (5Hawley S.A. Boudeau J. Reid J.L. Mustard K.J. Udd L. Makela T.P. Alessi D.R. Hardie D.G. J. Biol. 2003; 2: 28-37Crossref PubMed Google Scholar, 6Woods A. Johnstone S.R. Dickerson K. Leiper F.C. Fryer L.G. Neumann D. Schlattner U. Wallimann T. Carlson M. Carling D. Curr. Biol. 2003; 13: 2004-2008Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1371) Google Scholar, 7Shaw R.J. Kosmatka M. Bardeesy N. Hurley R.L. Witters L.A. DePinho R.A. Cantley L.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 3329-3335Crossref PubMed Scopus (1480) Google Scholar). Several lines of evidence point to the presence of non-LKB1 AMPKKs. Multiple AMPKK activities are separable during chromatography of extracts from rodent heart (8Altarejos J.Y. Taniguchi M. Clanachan A.S. Lopaschuk G.D. J. Biol. Chem. 2005; 280: 183-190Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (87) Google Scholar, 9Baron S.J. Li J. Russell III, R.R. Neumann D. Miller E.J. Tuerk R. Wallimann T. Hurley R.L. Witters L.A. Young L.H. Circ. Res. 2005; 96: 337-345Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). Murine fibroblasts obtained from LKB1-/- embryos by two different groups still demonstrate residual AMPKT172α phosphorylation and AMPK activity, albeit not as responsive to the usual activators of AMPK, such as the nucleoside AICAR (5Hawley S.A. Boudeau J. Reid J.L. Mustard K.J. Udd L. Makela T.P. Alessi D.R. Hardie D.G. J. Biol. 2003; 2: 28-37Crossref PubMed Google Scholar, 7Shaw R.J. Kosmatka M. Bardeesy N. Hurley R.L. Witters L.A. DePinho R.A. Cantley L.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 3329-3335Crossref PubMed Scopus (1480) Google Scholar). Partially purified Ca2+/CaM-dependent protein kinase kinase (CaMKK) from pig brain has been shown to be active in vitro on AMPK, but it was concluded that the kinetics of phosphorylation by CaMKK were weaker than those for a partially purified AMPKK and that CaMKKs were unlikely to function as AMPKKs in intact cells and tissues (10Hawley S.A. Selbert M.A. Goldstein E.G. Edelman A.M. Carling D. Hardie D.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 27186-27191Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (371) Google Scholar). Although this view has been widely accepted (28Carling D. Trends Biochem. Sci. 2004; 29: 18-24Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (970) Google Scholar), Nath et al. (2Nath N. McCartney R.R. Schmidt M.C. Mol. Cell. Biol. 2003; 23: 3909-3917Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar) suggested that CaMKKβ may be an AMPKK based on homology with yeast PAK1. Recently, CaMKKα has been shown directly to function as a Snf1-activating kinase in yeast cells lacking the three Snf-activating kinases, Pak1, Tos3, and Elm1 (29Hong S.-P. Momcilovic M. Carlson M. J. Biol. Chem. 2005; 280: 21804-21809Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (103) Google Scholar). The protein products of the CaMKK gene family, CaMKKα and CaMKKβ, show significant homology to LKB1 and to the three aforementioned yeast kinases (3Hong S.P. Leiper F.C. Woods A. Carling D. Carlson M. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 8839-8843Crossref PubMed Scopus (487) Google Scholar, 4Sutherland C.M. Hawley S.A. McCartney R.R. Leech A. Stark M.J. Schmidt M.C. Hardie D.G. Curr. Biol. 2003; 13: 1299-1305Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (225) Google Scholar, 5Hawley S.A. Boudeau J. Reid J.L. Mustard K.J. Udd L. Makela T.P. Alessi D.R. Hardie D.G. J. Biol. 2003; 2: 28-37Crossref PubMed Google Scholar). In the present study, we have investigated the possibility that one or both CaMKKs might serve as AMPKKs to regulate AMPK in cell lines lacking expression of LKB1. Cell Culture and Incubations—Panc-1, AsPC-1, and COS cells were purchased from ATCC. Mouse embryo fibroblasts (MEFs) from LKB1+/+ and LKB1-/- mice and HeLa cells were kindly provided by Reuben Shaw (Harvard University). These cell lines were grown in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin. A549 cells (ATCC) were grown in Ham's F-12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 100 units/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin. All cell lines were maintained at 37 °C in a humidified atmosphere containing 5% CO2. Cells were incubated in 6-well plates after various additions (see the figure legends) prior to extraction for immunoblotting and analysis of AMPK activity. Preparation of Cell Extracts—Cell extracts were prepared by three different methods. For analysis of AMPK activity, digitonin lysis followed by ammonium sulfate precipitation was employed, as in Ref. 11Witters L.A. Kemp B.E. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2864-2867Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar. For immunoblotting of total cellular protein, cells were lysed either in a Triton X-100-containing buffer, as in Ref. 12Hamilton S.R. O'Donnell Jr., J.B. Hammet A. Stapleton D. Habinowski S.A. Means A.R. Kemp B.E. Witters L.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 293: 892-898Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar, or in an SDS-containing buffer. For the latter, cells were rinsed with phosphate-buffered saline (2×) and lysed directly on the plate with boiling SDS buffer (1% SDS, 100 mm NaCl, 10 mm Tris-HCl, pH 7.5). These extracts were then sheared with a 25-gauge needle and boiled for 5 min. Protein concentration in all extracts was determined with a BCA assay (Pierce), according to the manufacturer's protocol. Enzyme Activities and Immunoblotting—AMPK activity against the SAMS peptide was determined at a saturating concentration of AMP, as in Ref. 11Witters L.A. Kemp B.E. J. Biol. Chem. 1992; 267: 2864-2867Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar. AMPKK activity in Triton X-100 cell lysates was determined by phosphorylation of a recombinant AMPKα protein, as in Ref. 12Hamilton S.R. O'Donnell Jr., J.B. Hammet A. Stapleton D. Habinowski S.A. Means A.R. Kemp B.E. Witters L.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 293: 892-898Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar. Cell extracts were examined by immunoblotting, as in Ref. 12Hamilton S.R. O'Donnell Jr., J.B. Hammet A. Stapleton D. Habinowski S.A. Means A.R. Kemp B.E. Witters L.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 293: 892-898Crossref PubMed Scopus (55) Google Scholar, employing a panel of different antibodies/reagents. These included anti-AMPK total α (reactive against α and α2), anti-AMPKαT172p, anti-ACCS79p, streptavidin-HRP (13Hamilton S.R. Stapleton D. O'Donnell Jr., J.B. Kung J.T. Dalal S.R. Kemp B.E. Witters L.A. FEBS Lett. 2001; 500: 163-168Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar), anti-CaMKKα/β (C-terminal; BD Transduction Laboratories catalog number 610544), and anti-LKB1 (a kind gift from Reuben Shaw and Ronald DePhino (Harvard University)) (7Shaw R.J. Kosmatka M. Bardeesy N. Hurley R.L. Witters L.A. DePinho R.A. Cantley L.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 3329-3335Crossref PubMed Scopus (1480) Google Scholar). RNA Interference—siRNA oligonucleotides against a scrambled, non-targeting sequence as a negative control (D-001206-13-20) and CaMKKβ (human CaMKK2, SiGENOME SMARTpool reagent M-004842-00-0050, accession number NM_006549) were obtained from Dharmacon Research (Lafeyette, CO). siRNA oligonucleotides designed against CaMKKα (siRNA Gene Silencers, human) were obtained from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). HeLa cells were plated at a density of 5 × 105 cells/well in a 6-well plate and allowed to adhere overnight. Cells were transfected with a non-targeting control siRNA pool (200 nm), CaMKKβ siRNA pool (100 nm), or CaMKKα siRNA (200 nm). Preliminary studies established that the latter two were employed at their maximally effective concentrations (data not shown). Transfection was carried out using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. At 48 h after transfection, cells were either harvested or treated with AMPK activators and then harvested. Preparation of LKB1/STRAD/Mo25 Complex—COS cells were triply transfected with cDNAs expressing glutathione S-transferase-tagged LKB1 and FLAG-tagged STRAD and Mo25 (generous gifts from Reuben Shaw (Harvard University) and Dario Alessi (University of Dundee)) using Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's protocol. Cells were lysed in buffer containing 1% Triton X-100, as described above, 48 h after transfection. Cleared supernatants were aliquoted into microcentrifuge tubes (1 ml/tube) and incubated with 100 μl of 50% glutathione bead slurry (Sigma) for 2 h at 4 °C. Lysates were spun down briefly (20 s, 14,000 rpm) to gently pellet beads. The supernatant was carefully removed, and beads were washed once with buffer containing 1% Triton X-100 and then subsequently washed two times with 4× assay buffer (0.4 m HEPES, 0.6 m NaCl). Beads were then resuspended in 4× assay buffer containing 20 mm glutathione (Sigma) to elute the enzyme complex. Following a 20-min incubation on ice, samples are spun down for 1–2 min at 14,000 rpm to firmly pellet beads, and the supernatant, containing the purified LKB1/STRAD/Mo25 complex, was removed and used immediately in the in vitro kinase kinase assays. Statistical Analysis—Statistical analysis of experimental data were performed by a factorial ANOVA with multiple comparisons, using the least significant difference by the STATISTICA software package. In an effort to identify AMPKKs distinct from LKB1, two human cell lines that are deficient in LKB1 were selected for study, the cervical carcinoma-derived HeLa and the lung adenocarcinoma-derived A549 lines. LKB1 is not detectable in these two lines nor in LKB1-/- mouse embryo fibroblasts by immunoblotting (Fig. 1). We did detect expression of LKB1 in other human cancer lines including PANC-1 and AsPC-1, the latter previously thought to be LKB1-negative (14Qanungo S. Haldar S. Basu A. Neoplasia. 2003; 5: 367-374Crossref PubMed Google Scholar). HeLa and A549 cells were stimulated with a variety of agents known to activate AMPK by increasing phosphorylation of AMPKαT172 and with ionomycin, the latter to increase intracellular Ca2+. Mannitol, 2-deoxyglucose (2-DG), and ionomycin, but not AICAR, markedly stimulate both AMPK activity (Fig. 2A) and αT172 phosphorylation (Fig. 2B, top panel) in HeLa cells. In A549 cells, mannitol and 2-deoxyglucose (2-DG), but not AICAR (data not shown), also stimulated AMPK activity and phosphorylation (Supplemental Fig. 1). The inability of AICAR to stimulate AMPK in HeLa cells and in LKB1-/- mouse embryo fibroblasts has been observed previously (5Hawley S.A. Boudeau J. Reid J.L. Mustard K.J. Udd L. Makela T.P. Alessi D.R. Hardie D.G. J. Biol. 2003; 2: 28-37Crossref PubMed Google Scholar, 7Shaw R.J. Kosmatka M. Bardeesy N. Hurley R.L. Witters L.A. DePinho R.A. Cantley L.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 3329-3335Crossref PubMed Scopus (1480) Google Scholar). The above experiments indicate the presence of AMPKK(s) in HeLa and A549 cells distinct from LKB1. Two other mammalian protein kinases have a significant homology to mammalian LKB1 and to the LKB1 orthologs in S. cerevisiae, namely Ca2+/CaM-dependent protein kinase kinase α (CaMKKα) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase kinase β (CaMKKβ) (15Selbert M.A. Anderson K.A. Huang Q.H. Goldstein E.G. Means A.R. Edelman A.M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 17616-17621Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (139) Google Scholar, 16Edelman A.M. Mitchelhill K.I. Selbert M.A. Anderson K.A. Hook S.S. Stapleton D. Goldstein E.G. Means A.R. Kemp B.E. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10806-10810Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (93) Google Scholar, 17Anderson K.A. Means R.L. Huang Q.H. Kemp B.E. Goldstein E.G. Selbert M.A. Edelman A.M. Fremeau R.T. Means A.R. J. Biol. Chem. 1998; 273: 31880-31889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (220) Google Scholar, 18Soderling T.R. Trends Biochem. Sci. 1999; 24: 232-236Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (448) Google Scholar, 19Soderling T.R. Stull J.T. Chem. Rev. 2001; 101: 2341-2352Crossref PubMed Scopus (168) Google Scholar, 20Corcoran E.E. Means A.R. Edelman A.M. Mitchelhill K.I. Selbert M.A. Anderson K.A. Hook S.S. Stapleton D. Goldstein E.G. Kemp B.E. Huang Q.H. J. Biol. Chem. 2001; 276: 2975-2978Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (134) Google Scholar). A CaMKK preparation from pig brain (isolated prior to the recognition that there were two isoforms of the enzyme) has previously been shown to phosphorylate and activate AMPK in vitro; this phosphorylation is enhanced by the binding of AMP to the AMPK heterotrimer (10Hawley S.A. Selbert M.A. Goldstein E.G. Edelman A.M. Carling D. Hardie D.G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 27186-27191Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (371) Google Scholar). Since both CaMKKα and CaMKKβ are expressed in HeLa cells (but not in murine embryonic fibroblasts), 2R. L. Hurley, K. A. Anderson, J. M. Franzone, B. E. Kemp, A. R. Means, and L. A. Witters, unpublished observations. 1 they were chosen for study of the possible roles for these enzymes (21Ishikawa Y. Tokumitsu H. Inuzuka H. Murata-Hori M. Hosoya H. Kobayashi R. FEBS Lett. 2003; 550: 57-63Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar). To test the hypothesis that one or both CaMKKs in HeLa cells functions as an AMPKK, HeLa cells were incubated under basal conditions or were stimulated with mannitol, 2-DG, or ionomycin in the presence of the CaMKK inhibitor, STO-609 (22Tokumitsu H. Inuzuka H. Ishikawa Y. Ikeda M. Saji I. Kobayashi R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 15813-15818Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (240) Google Scholar, 23Tokumitsu H. Inuzuka H. Ishikawa Y. Kobayashi R. J. Biol. Chem. 2003; 278: 10908-10913Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (42) Google Scholar). At a concentration of 1 μg/ml, STO-609 significantly inhibits AMPK activation and αT172 phosphorylation in response to all three agents in HeLa cells (Fig. 2). The degree of inhibition of STO-609 was greatest in the ionomycin-stimulated cells (Fig. 2A). Since STO-609 did not, however, totally block the activation and phosphorylation of AMPK in response to mannitol and 2-DG, this might suggest that these cells possess residual LKB1 (although undetectable by immunoblot) or perhaps another AMPKK. STO-609 also inhibited AMPK activation in response to mannitol and 2-DG in A549 cells (Supplemental Fig. 1). Dose-dependent activation by 2-DG of AMPK αT172 phosphorylation and phosphorylation of a downstream target of activated AMPK, acetyl-CoA carboxylase (ACC), were significantly inhibited by STO-609 in HeLa cells at 2-DG concentrations of ≤10 mm (Fig. 3). The IC50 for STO-609 inhibition of 2-DG-stimulated αT172 phosphorylation in HeLa cells was ∼0.7 μg/ml (data not shown). In other experiments (data not shown), we have found that STO-609 can inhibit the in vitro activity of purified AMPK against the SAMS peptide, although the IC50 is 20-fold higher than that for the CaMKKs. Thus, we cannot exclude the possibility that some fraction of the STO-609 inhibition of ACC phosphorylation in intact cells is due to the direct inhibition of AMPK, although the concentrations we employed in these intact cells studies was 1 μg/ml. However, αT172 is not an AMPK auto-phosphorylation site, so any effects of STO-609 cannot be accounted for by inhibition of auto-regulation. CaMKKα activity is largely dependent upon Ca2+ and CaM, whereas CaMKKβ has substantial constitutive activity in its absence, although it can be stimulated by a rise in Ca2+ (15Selbert M.A. Anderson K.A. Huang Q.H. Goldstein E.G. Means A.R. Edelman A.M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 17616-17621Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (139) Google Scholar, 16Edelman A.M. Mitchelhill K.I. Selbert M.A. Anderson K.A. Hook S.S. Stapleton D. Goldstein E.G. Means A.R. Kemp B.E. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10806-10810Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (93) Google Scholar, 17Anderson K.A. Means R.L. Huang Q.H. Kemp B.E. Goldstein E.G. Selbert M.A. Edelman A.M. Fremeau R.T. Means A.R. J. Biol. Chem. 1998; 273: 31880-31889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (220) Google Scholar). Ionomycin increases intracellular Ca2+ via an initial phase representing mobilization of intracellular stores and a sustained component representing Ca2+ influx (24Morgan A.J. Jacob R. Biochem. J. 1994; 300: 665-672Crossref PubMed Scopus (262) Google Scholar). In HeLa cells, the marked increase in AMPK activity and αT172 phosphorylation in response to ionomycin (Fig. 2) might thus be due to a Ca2+ stimulation of either of the CaMKKs. In support of this hypothesis, STO-609 completely blocks the ability of ionomycin to elicit these changes in AMPK (Fig. 2). AMPKK activity, measured in HeLa cell lysates against a recombinant AMPKα in vitro, was completely inhibited by STO-609 (Fig. 4A). The IC50 for this in vitro STO-609 inhibition was ∼0.02 μg/ml (data not shown). This IC50 value is comparable with that reported for the inhibition of recombinant CaMKKα (0.12 μg/ml) and CaMKKβ (0.04 μg/ml) phosphorylation of a Ca2+/calmodulin-dependent kinase I (CaMKI) fusion protein in vitro (22Tokumitsu H. Inuzuka H. Ishikawa Y. Ikeda M. Saji I. Kobayashi R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 15813-15818Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (240) Google Scholar). The IC5o of STO-609 against several other protein kinases (CaM kinases I, II, and IV, myosin light chain kinase, protein kinase C, cAMP-dependent protein kinase, and p42 MAP kinase) exceeds 10 μg/ml, establishing (in part) its specificity and potency as a CaMKK inhibitor (22Tokumitsu H. Inuzuka H. Ishikawa Y. Ikeda M. Saji I. Kobayashi R. J. Biol. Chem. 2002; 277: 15813-15818Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (240) Google Scholar). Additionally we have demonstrated that at these concentrations, STO-609 does not inhibit the activity of a LKB1/STRAD/Mo25 heterotrimer against the recombinant AMPKα in vitro (Fig. 4B), suggesting the potential utility of this inhibitor in establishing the relative roles of the CaMKKs and LKB1 as AMPKKs in various tissues or cell preparations. STO-609, whereas specific for the CaMKKs, however cannot clearly distinguish between the two CaMKK isoforms, CaMKKα and CaMKKb. HeLa cells have been reported to express both CaMKKα and CaMKKβ mRNAs (21Ishikawa Y. Tokumitsu H. Inuzuka H. Murata-Hori M. Hosoya H. Kobayashi R. FEBS Lett. 2003; 550: 57-63Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar). The CaMKKβ gene encodes several isoforms generated through differential usage of polyadenylation sites and/or as a result of alternative splicing of the internal exons 14 and/or 16 (21Ishikawa Y. Tokumitsu H. Inuzuka H. Murata-Hori M. Hosoya H. Kobayashi R. FEBS Lett. 2003; 550: 57-63Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar, 25Hsu L.S. Chen G.D. Lee L.S. Chi C.W. Cheng J.F. Chen J.Y. J. Biol. Chem. 2001; 276: 31113-31123Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (38) Google Scholar), although the characteristics of the protein products (gel mobility, kinase activity, and tissue distribution) have not been fully delineated. In HeLa cells, the β1 and β2 isoforms are absent; mRNAs encoding two novel CaMKK isoforms (CaMKKβ3 and CaMKKβ3x) generated through alternative splicing have been noted (21Ishikawa Y. Tokumitsu H. Inuzuka H. Murata-Hori M. Hosoya H. Kobayashi R. FEBS Lett. 2003; 550: 57-63Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar). As probed with a monoclonal antibody that recognizes a C-terminal sequence common to CaMKKα and CaMKKβ, HeLa cell extracts display two immunoreactive species, migrating similarly to a CaMKKα standard and at the predicted molecular masses of CaMKKβ3 (60 kDa) and CaMKKβ3x (55 kDa) (Fig. 5A) (21Ishikawa Y. Tokumitsu H. Inuzuka H. Murata-Hori M. Hosoya H. Kobayashi R. FEBS Lett. 2003; 550: 57-63Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar). Given the possibility that the effects of STO-609 to inhibit AMPK activity were not entirely mediated by specific chemical inhibition of the CaMKKs, we employed RNA interference as an independent way to inhibit their activity. As compared with transfected non-targeting siRNA, CaMKKβ-specific siRNA substantially decreased basal and 2-DG-stimulated AMPK activity and αT172 phosphorylation, whereas CaMKKα-specific siRNA had smaller, but still apparent, effects on these 2-DG-stimulated AMPK alterations (Fig. 6A). No significant effects of the individual siRNAs on 2-DG-stimulated ACC phosphorylation are seen, and this is likely explained by the residual 2-DG-stimulated AMPK activity (Fig. 6B). We have noted that the phosphorylation of ACC in other systems is very sensitive to even small changes in AMPK activity (27Chen Z.P. Stephens T.J. Murthy S. Canny B.J. Hargreaves M. Witters L.A. Kemp B.E. McConell G.K. Diabetes. 2003; 52: 2205-2212Crossref PubMed Scopus (280) Google Scholar). The combination of both CaMKK siRNAs nearly eliminated both basal and stimulated AMPK activity (Fig. 6A) and αT172 and ACC phosphorylation (Fig. 6B). Both CaMKKα- and CaMKKβ-specific siRNAs also significantly reduced ionomycin-stimulated AMPK activity (Fig. 7). CaMKKβ-specific siRNA eliminated the 55-kDa band and diminished the 60-kDa band observed on immunoblotting, whereas CaMKKα-specific siRNA diminished slightly the 60-kDa band observed (Fig. 5B). This observation indicates that the upper band in HeLa extracts is a mixture of CaMKKβ3 and CaMKKα and that the lower band is CaMKKβ3x. We have been unable to confirm the specificity of a commercially available CaMKKα antibody (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) to verify more precisely the composition of the 60-kDa band. The individual siRNAs have negligible effects on either ACC or total AMPKα, although total AMPKα is slightly diminished in the presence of both (Fig. 6B). The combined siRNAs eliminate nearly all immunoreactivity of the CaMKK bands (Fig. 5B), coincident with a near abrogation of AMPK activity and phosphorylation (Fig. 6).Fig. 7siRNA knockdown of CaMKKs reduces AMPK activation by ionomycin. HeLa cells were transfected with siRNAs against a non-targeting (NT) sequence, CaMKKα (indicated as αsiRNA), or CaMKKβ (indicated as βsiRNA) and incubated for 48 h. Cells were then incubated in the presence or absence of 1 μm ionomycin for 5 min and harvested by digitonin lysis. Extracts were assayed against the SAMS peptide as described under “Experimental Procedures,” to assess AMPK kinase activity. These results (n = 4 separate pooled lysates at each condition) are expressed as mean ± standard deviation of AMPK activity expressed as pmol of 32P incorporation into the SAMS peptide per minute per mg of protein. Open bars represent basal activity, and shaded bars represent ionomycin-stimulated activity. As determined by ANOVA analysis, the inhibition of basal AMPK activity by both siRNAs is significant at p < 0.001, and that of the inhibition of the stimulation by ionomycin by each siRNA is significant at p < 0.0001. For the entire data set, F(2,18) = 7.17, p < 0.005 for the effects of ionomycin.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) To examine the relative roles of LKB1 and the CaMKKs in a cultured cell line in which all three kinases are expressed, LKB1+/+ MEFs were stimulated with ionomycin and 2-DG in the presence and absence of STO-609. Basal and stimulated AMPK activity was then compared with that observed in LKB1-/- cells (Fig. 8). We and others have previously found that AICAR, hydrogen peroxide, and phenformin fail to activate AMPK in LKB1-/- MEFs (5Hawley S.A. Boudeau J. Reid J.L. Mustard K.J. Udd L. Makela T.P. Alessi D.R. Hardie D.G. J. Biol. 2003; 2: 28-37Crossref PubMed Google Scholar, 7Shaw R.J. Kosmatka M. Bardeesy N. Hurley R.L. Witters L.A. DePinho R.A. Cantley L.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004; 101: 3329-3335Crossref PubMed Scopus (1480) Google Scholar). Activation of AMPK (Fig. 8A) and αT172 phosphorylation (Fig. 8B) in response to ionomycin and 2-DG is not impaired in LKB1-/- MEFs as compared with LKB1+/+ cells. Indeed, the response to ionomycin appeared to be enhanced in the absence of LKB-1 expression. STO-609 partially blocks the response to ionomycin in both cell types, whereas its ability to inhibit 2-DG-stimulated AMPK activation is only observed in the LKB1-/- MEFs. These data revealed that ionomycin-induced AMPK activation is mediated largely through one or both CaMKKs, whereas the 2-DG response may be contributed to by either LKB1 or the CaMKKs. In the wild-type cells, however, any contribution of CaMKKs might be redundant to that of LKB1. We cannot, of course, exclude the involvement of yet-to-be characterized AMPKKs in either cell line. The data reported herein provide compelling evidence that both CaMKKs function as AMPKKs in the cell lines studied, making them attractive candidates for non-LKB1 AMPKKs in other tissues and cell lines. Although initially characterized and isolated from neuronal tissue, both CaMKKα and CaMKKβ have a wide expression in rodent tissues (16Edelman A.M. Mitchelhill K.I. Selbert M.A. Anderson K.A. Hook S.S. Stapleton D. Goldstein E.G. Means A.R. Kemp B.E. J. Biol. Chem. 1996; 271: 10806-10810Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (93) Google Scholar, 17Anderson K.A. Means R.L. Huang Q.H. Kemp B.E. Goldstein E.G. Selbert M.A. Edelman A.M. Fremeau R.T. Means A.R. J. Biol. Chem. 1998; 273: 31880-31889Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (220) Google Scholar, 26Vinet J. Carra S. Blom J.M. Harvey M. Brunello N. Barden N. Tascedda F. Brain Res. Mol. Brain Res. 2003; 111: 216-221Crossref PubMed Scopus (25) Google Scholar), suggesting important roles for each in the regulation of AMPK activity in vivo. The data further indicate that both cellular calcium and AMP may play separate or interdependent roles in the regulation of AMPK activity. With the recognition of three mammalian AMPKKs, future investigation will be required to characterize in detail their relative contributions to AMPK regulation in other individual tissues and cell types. Although LKB1 may be the predominant AMPKK regulating AMPK responses to contraction and phenformin in murine skeletal muscle (30.Sakamoto, K., McCarthy, A., Smith. D., Green, K. A., Grahame Hardie, D., Ashworth, A., and Alessi, D. R. (2005) 24, 1810-1820Google Scholar), it seems quite likely, given variable tissue expression of these AMPKKs, that there may be considerable heterogeneity in the regulation of AMPK under both basal and stimulated conditions, perhaps dependent on the nature of the stimulus. In addition, recent data from yeast indicate that the different β subunit-containing isoforms of the Snf1 kinase display stress-dependent preferences for Pak1, Tos3, and Elm1 upstream kinases (31McCartney R.R. Rubenstein E.M. Schmidt M.C. Curr. Genet. 2005; 47: 335-344Crossref PubMed Scopus (39) Google Scholar). Thus, it might be anticipated that different AMPK heterotrimers composed of varying combinations of different catalytic α subunits (α1, α2) and non-catalytic subunits (β1 and β2; γ1, γ2, and γ3) might be differentially regulated by the three mammalian AMPKKs, increasing the complexity of overall regulation of AMPK activity in vivo. We acknowledge the helpful advice and the provision of reagents from Hiroshi Tokumitsu (Kagawa University), Thomas Soderling (Oregon Health Sciences Center), Reuben Shaw and Ronald DePinho (Harvard University), and Dario Alessi (University of Dundee). Mark McPeek (Dartmouth College) gave valuable assistance with the statistical analysis. Download .pdf (.17 MB) Help with pdf files

The AMP‐activated protein kinase (AMPK) in rat skeletal and cardiac muscle is activated by vigorous exercise and ischaemic stress. Under these conditions AMPK phosphorylates and inhibits acetyl‐coenzyme A carboxylase causing increased oxidation of fatty acids. Here we show that AMPK co‐immunoprecipitates with cardiac endothelial NO synthase (eNOS) and phosphorylates Ser‐1177 in the presence of Ca 2+ ‐calmodulin (CaM) to activate eNOS both in vitro and during ischaemia in rat hearts. In the absence of Ca 2+ ‐calmodulin, AMPK also phosphorylates eNOS at Thr‐495 in the CaM‐binding sequence, resulting in inhibition of eNOS activity but Thr‐495 phosphorylation is unchanged during ischaemia. Phosphorylation of eNOS by the AMPK in endothelial cells and myocytes provides a further regulatory link between metabolic stress and cardiovascular function.

Although interleukin-6 (IL-6) has been associated with insulin resistance, little is known regarding the effects of IL-6 on insulin sensitivity in humans in vivo. Here, we show that IL-6 infusion increases glucose disposal without affecting the complete suppression of endogenous glucose production during a hyperinsulinemic-euglycemic clamp in healthy humans. Because skeletal muscle accounts for most of the insulin-stimulated glucose disposal in vivo, we examined the mechanism(s) by which IL-6 may affect muscle metabolism using L6 myotubes. IL-6 treatment increased fatty acid oxidation, basal and insulin-stimulated glucose uptake, and translocation of GLUT4 to the plasma membrane. Furthermore, IL-6 rapidly and markedly increased AMP-activated protein kinase (AMPK). To determine whether the activation of AMPK mediated cellular metabolic events, we conducted experiments using L6 myotubes infected with dominant-negative AMPK α-subunit. The effects described above were abrogated in AMPK dominant-negative–infected cells. Our results demonstrate that acute IL-6 treatment enhances insulin-stimulated glucose disposal in humans in vivo, while the effects of IL-6 on glucose and fatty acid metabolism in vitro appear to be mediated by AMPK.

Summary

 Dysfunctional mTORC1 signaling is associated with a number of human pathologies owing to its central role in controlling cell growth, proliferation, and metabolism. Regulation of mTORC1 is achieved by the integration of multiple inputs, including those of mitogens, nutrients, and energy. It is thought that agents that increase the cellular AMP/ATP ratio, such as the antidiabetic biguanides metformin and phenformin, inhibit mTORC1 through AMPK activation of TSC1/2-dependent or -independent mechanisms. Unexpectedly, we found that biguanides inhibit mTORC1 signaling, not only in the absence of TSC1/2 but also in the absence of AMPK. Consistent with these observations, in two distinct preclinical models of cancer and diabetes, metformin acts to suppress mTORC1 signaling in an AMPK-independent manner. We found that the ability of biguanides to inhibit mTORC1 activation and signaling is, instead, dependent on the Rag GTPases.

Abstract —The activity of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) can be regulated independently of an increase in Ca 2+ by the phosphorylation of Ser 1177 but results only in a low nitric oxide (NO) output. In the present study, we assessed whether the agonist-induced (Ca 2+ -dependent, high-output) activation of eNOS is associated with changes in the phosphorylation of Thr 495 in the calmodulin (CaM)-binding domain. eNOS Thr 495 was constitutively phosphorylated in porcine aortic endothelial cells and was rapidly dephosphorylated after bradykinin stimulation. In the same cells, bradykinin enhanced the phosphorylation of Ser 1177 , which was maximal after 5 minutes, and abolished by the CaM-dependent kinase II (CaMKII) inhibitor KN-93. Bradykinin also enhanced the association of CaMKII with eNOS. Phosphorylation of Thr 495 was attenuated by the protein kinase C (PKC) inhibitor Ro 31-8220 and after PKC downregulation using phorbol 12-myristate 13-acetate. The agonist-induced dephosphorylation of Thr 495 was completely Ca 2+ -dependent and inhibited by the PP1 inhibitor calyculin A. Little CaM was bound to eNOS immunoprecipitated from unstimulated cells, but the agonist-induced dephosphorylation of Thr 495 enhanced the association of CaM. Mutation of Thr 495 to alanine increased CaM binding to eNOS in the absence of cell stimulation, whereas the corresponding Asp 495 mutant bound almost no CaM. Accordingly, NO production by the Ala 495 mutant was more sensitive to Ca 2+ /CaM than the aspartate mutant. These results suggest that the dual phosphorylation of Ser 1177 and Thr 495 determines the activity of eNOS in agonist-stimulated endothelial cells. Moreover, the dephosphorylation of Thr 495 by PP1 precedes the phosphorylation of Ser 1177 by CaMKII. The full text of this article is available at http://www.circresaha.org.

A protein with biological activities similar to parathyroid hormone (PTH) has been purified from serum-free culture medium obtained from a human lung cancer cell line (BEN). A major protein band of 18 kDa was obtained on NaDodSO4/polyacrylamide gels, with faint bands at 35 kDa and 67 kDa. Biological activity was associated only with the 18-kDa band. Amino acid sequence analysis of the material purified by HPLC revealed that 8 of the 16 residues were identical with those of human PTH. Antibody raised to a corresponding synthetic peptide recognized the PTH-related material but showed less than 1% cross-reactivity with human PTH amino-terminal peptides. BEN cells contained PTH DNA, but not PTH messenger RNA, indicating involvement of another gene. The purified PTH-related protein had a specific biological activity approximately equal to 6 times greater than that of bovine PTH(1-34). The PTH-related protein may have a role in the syndrome of humoral hypercalcemia of malignancy.

Metformin is one of the most widely prescribed therapeutics for type 2 diabetes. But exactly how it works is still unclear. Gregory Steinberg and colleagues now show that it does so by activation of the enzyme AMP-activated protein kinase (Ampk) and Ampk's obligate targeting of two key enzymes involved in lipid homeostasis. The obesity epidemic has led to an increased incidence of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) and type 2 diabetes. AMP-activated protein kinase (Ampk) regulates energy homeostasis and is activated by cellular stress, hormones and the widely prescribed type 2 diabetes drug metformin1,2. Ampk phosphorylates mouse acetyl-CoA carboxylase 1 (Acc1; refs. 3,4) at Ser79 and Acc2 at Ser212, inhibiting the conversion of acetyl-CoA to malonyl-CoA. The latter metabolite is a precursor in fatty acid synthesis5 and an allosteric inhibitor of fatty acid transport into mitochondria for oxidation6. To test the physiological impact of these phosphorylation events, we generated mice with alanine knock-in mutations in both Acc1 (at Ser79) and Acc2 (at Ser212) (Acc double knock-in, AccDKI). Compared to wild-type mice, these mice have elevated lipogenesis and lower fatty acid oxidation, which contribute to the progression of insulin resistance, glucose intolerance and NAFLD, but not obesity. Notably, AccDKI mice made obese by high-fat feeding are refractory to the lipid-lowering and insulin-sensitizing effects of metformin. These findings establish that inhibitory phosphorylation of Acc by Ampk is essential for the control of lipid metabolism and, in the setting of obesity, for metformin-induced improvements in insulin action.

An Aspirin a Day? The protein kinase AMPK (adenosine monophosphate–activated protein kinase) directly monitors cellular energy stores as reflected by changes in cellular concentrations of AMP, adenosine diphosphate (ADP), and adenosine triphosphate (ATP). Through phosphorylation of its targets, it helps to control metabolism, polarity, autophagy, and the restraint of cell proliferation. Activation of AMPK is also proposed to be beneficial for the treatment of diseases, including cancer and diabetes. Hawley et al. (p. 918 , published online 19 April; see the Perspective by Shaw and Cantley ) report that AMPK can be activated by high concentrations of salicylate, a compound derived from the very commonly used drug aspirin. In mice, salicylate promoted fatty acid and carbohydrate metabolism in an AMPK-dependent fashion.