The lac operon of Escherichia coli is the paradigm for gene regulation. Its key component is the lac repressor, a product of the lacI gene. The three-dimensional structures of the intact lac repressor, the lac repressor bound to the gratuitous inducer isopropyl-β-D-1-thiogalactoside (IPTG) and the lac repressor complexed with a 21-base pair symmetric operator DNA have been determined. These three structures show the conformation of the molecule in both the induced and repressed states and provide a framework for understanding a wealth of biochemical and genetic information. The DNA sequence of the lac operon has three lac repressor recognition sites in a stretch of 500 base pairs. The crystallographic structure of the complex with DNA suggests that the tetrameric repressor functions synergistically with catabolite gene activator protein (CAP) and participates in the quaternary formation of repression loops in which one tetrameric repressor interacts simultaneously with two sites on the genomic DNA.

Abstract Viroporins are small viral ion channels that play important roles in the viral infection cycle and are proven antiviral drug targets. Matrix protein 2 from influenza A (AM2) is the best characterized viroporin, and the current paradigm is that AM2 forms monodisperse tetramers. Here, we used native mass spectrometry and other techniques to characterize the oligomeric state of both the full-length and transmembrane domain (TM) of AM2 in a variety of different pH and detergent conditions. Unexpectedly, we discovered that AM2 formed a range of different oligomeric complexes that were strongly influenced by the local chemical environment. Native mass spectrometry of AM2 in nanodiscs with different lipids showed that lipids also affected the oligomeric states of AM2. Finally, nanodiscs uniquely enabled measurement of amantadine binding stoichiometries to AM2 in the intact lipid bilayer. These unexpected results reveal that AM2 can form a wider range of oligomeric states than previously thought possible, which may provide new potential mechanisms of influenza pathology and pharmacology. Significance Statement Many viruses contain small ion channels called viroporins that play diverse roles in viral infections. Influenza A M2 (AM2) is the best characterized viroporin and the target of the antivirals amantadine and rimantadine. Although past structural studies showed AM2 was a monodisperse tetramer, we discovered that AM2 can form polydisperse and dynamic oligomers that are sensitive to their local chemical environment. Our findings provide a new perspective on the structure and mechanisms of AM2 that may extend to other viroporins.

In age-related macular degeneration (AMD) and Sorsby's fundus dystrophy (SFD), lipid-rich deposits known as drusen accumulate under the retinal pigment epithelium (RPE). Drusen may contribute to photoreceptor and RPE degeneration in AMD and SFD. We hypothesize that stimulating β-oxidation in RPE will reduce drusen accumulation. Inhibitors of acetyl-CoA carboxylase (ACC) stimulate β-oxidation and diminish lipid accumulation in fatty liver disease. In this report we test the hypothesis that an ACC inhibitor, Firsocostat, limits the accumulation of lipid deposits in cultured RPE cells.We probed metabolism and cellular function in mouse RPE-choroid, human fetal- derived RPE cells, and induced pluripotent stem cell-derived RPE cells. We used 13 C6-glucose and 13 C16-palmitate to determine the effects of Firsocostat on glycolytic, Krebs cycle, and fatty acid metabolism. 13 C labeling of metabolites in these pathways were analyzed using gas chromatography-linked mass spectrometry. We quantified ApoE and VEGF release using enzyme-linked immunosorbent assays. Immunostaining of sectioned RPE was used to visualize ApoE deposits. RPE function was assessed by measuring the trans-epithelial electrical resistance (TEER).ACC inhibition with Firsocostat increases fatty acid oxidation and remodels lipid composition, glycolytic metabolism, lipoprotein release, and enhances TEER. When human serum is used to induce sub-RPE lipoprotein accumulation, fewer lipoproteins accumulate with Firsocostat. In a culture model of Sorsby's fundus dystrophy, Firsocostat also stimulates fatty acid oxidation, improves morphology, and increases TEER.Firsocostat remodels intracellular metabolism and improves RPE resilience to serum-induced lipid deposition. This effect of ACC inhibition suggests that it could be an effective strategy for diminishing drusen accumulation in the eyes of patients with AMD.

ABSTRACT Two new structures of the N-terminal domain of the main replication protein, NS1, of Human Parvovirus B19 (B19V) are presented. This domain (NS1-nuc) plays an important role in the “rolling hairpin” replication of the single-stranded B19V DNA genome, recognizing origin of replication sequences in double-stranded DNA, and cleaving ( i.e . nicking) single-stranded DNA at a nearby site known as the trs. One structure of NS1-nuc is solved to 2.4 Å and shows the positions of two bound phosphate ions. A second structure shows the position of a single divalent cation in the DNA nicking active site. The threedimensional structure of NS1-nuc is well conserved between the two forms, as well as with a previously solved structure of a sequence variant of the same domain, however shown here at significantly higher resolution. Using structures of NS1-nuc homologues bound to single- and double-stranded DNA, models for DNA recognition and nicking by B19V NS1-nuc are presented which predict residues important for DNA cleavage and for sequence specific recognition at the viral origin of replication.

Lipid-rich deposits called drusen accumulate under the retinal pigment epithelium (RPE) in the eyes of patients with age-related macular degeneration (AMD) and Sorsby's fundus dystrophy (SFD). Drusen may contribute to photoreceptor and RPE degeneration in these blinding diseases. We hypothesize that stimulating β-oxidation of fatty acids could decrease the availability of lipid with which RPE cells can generate drusen. Inhibitors of acetyl-CoA carboxylase (ACC) stimulate β-oxidation and diminish lipid accumulation in fatty liver disease. In this report we test the hypothesis that an ACC inhibitor, Firsocostat, can diminish lipid deposition by RPE cells. We probed metabolism and cellular function in mouse RPE-choroid tissue and in cultured human RPE cells. We used

Filament or run-on oligomer formation by enzymes is increasingly recognized as an important phenomenon with potentially unique regulatory properties and biological roles. SgrAI is an allosterically regulated type II restriction endonuclease that forms run-on oligomeric (ROO) filaments with enhanced DNA cleavage activity and altered sequence specificity. Here, we present the 3.5 A cryo-electron microscopy structure of the ROO filament of SgrAI bound to a mimic of cleaved primary site DNA and Mg2+. Large conformational changes stabilize a second metal ion cofactor binding site within the catalytic pocket and facilitate assembling a higher-order enzyme form that is competent for rapid DNA cleavage. The structural changes illuminate the mechanistic origin of hyper-accelerated DNA cleavage activity within the filamentous SgrAI form. An analysis of the protein-DNA interface and the stacking of individual nucleotides reveals how indirect DNA readout within filamentous SgrAI enables recognition of substantially more nucleotide sequences than its low-activity form, thereby expanding DNA sequence specificity. Together, substrate DNA binding, indirect readout, and filamentation simultaneously enhance SgrAI's catalytic activity and modulate substrate preference. This unusual enzyme mechanism may have evolved to perform the specialized functions of bacterial innate immunity in rapid defense against invading phage DNA without causing damage to the host DNA.