Enzymes can evolve new catalytic activity when their environments change to present them with novel substrates. Despite this seemingly straightforward relationship, factors other than the direct catalytic target can also impact enzyme adaptation. Here, we characterize the adaptive landscape separating an ancestral dihydrocoumarin hydrolase from a methyl parathion hydrolase descendant under eight different environments supplemented with alternative divalent metals. This variation shifts an evolutionary watershed, causing the outcome of adaptation to depend on the environment in which it occurs. The resultant landscapes also vary in terms both the number and the genotype(s) of fitness peaks as a result of genotype-by-environment (GxE) interactions and environment- dependent epistasis (GxGxE). This suggests that adaptive landscapes may be fluid and that molecular adaptation is highly contingent not only on obvious factors (such as catalytic targets) but also on less obvious secondary environmental factors that can direct it toward distinct outcomes.

Genetic variation among orthologous proteins can cause cryptic phenotypic properties that only manifest in changing environments. Such variation may also impact the evolutionary potential of proteins, but the molecular basis for this remains unclear. Here we perform comparative directed evolution in which four orthologous metallo-β- lactamases were evolved toward a new function. We found that genetic variation between these enzymes resulted in distinct evolutionary outcomes. The ortholog with the lower initial activity reached a 20-fold higher fitness plateauexclusively via increasing catalytic activity. By contrast, the ortholog with the highest initial activity evolved to a less-optimal and phenotypically distinct outcome through changes in expression, oligomerization and activity. We show that the cryptic molecular properties and conformational variation of residues in the initial genotypes cause epistasis, thereby constraining evolutionary outcomes. Our work highlights that understanding the molecular details relating genetic variation to protein functions is essential to predicting the evolution of proteins.

Characterizing the adaptive landscapes that encompass the emergence of novel enzyme functions can provide molecular insights into both enzymatic and evolutionary mechanisms. Here, we combine ancestral protein reconstruction with biochemical, structural, and mutational analyses to characterize the functional evolution of methyl-parathion hydrolase (MPH), a xenobiotic organophosphate-degrading enzyme. We identify five mutations that are necessary and sufficient for the evolution of MPH from an ancestral dihydrocoumarin hydrolase. In-depth analyses of the adaptive landscapes encompassing this evolutionary transition revealed that a complex interaction network, defined in part by higher-order epistasis, determined the adaptive pathways that were available. By also characterizing the adaptive landscapes in terms of their functional activity towards three other OP substrates, we reveal that subtle differences in substrate substituents drastically alter the enzymes epistatic network by changing its intramolecular interactions. Our work suggests that the mutations function collectively to enable substrate recognition via subtle structural repositioning.