A hexanucleotide repeat expansion (HRE), (GGGGCC)n, in C9orf72 is the most common genetic cause of the neurodegenerative diseases amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD). Here we identify a molecular mechanism by which structural polymorphism of the HRE leads to ALS/FTD pathology and defects. The HRE forms DNA and RNA G-quadruplexes with distinct structures and promotes RNA•DNA hybrids (R-loops). The structural polymorphism causes a repeat-length-dependent accumulation of transcripts aborted in the HRE region. These transcribed repeats bind to ribonucleoproteins in a conformation-dependent manner. Specifically, nucleolin, an essential nucleolar protein, preferentially binds the HRE G-quadruplex, and patient cells show evidence of nucleolar stress. Our results demonstrate that distinct C9orf72 HRE structural polymorphism at both DNA and RNA levels initiates molecular cascades leading to ALS/FTD pathologies, and provide the basis for a mechanistic model for repeat-associated neurodegenerative diseases. Structurally polymorphic C9orf72 hexanucleotide repeats cause an impairment in transcriptional processivity and lead to accumulation of truncated repeat-containing transcripts that bind to specific ribonucleoproteins, such as nucleolin, in a conformation-dependent manner resulting in nucleolar stress and C9orf72-linked pathology in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Repeat expansions — mutations in which extra copies of tandemly repeated DNA sequence are generated — underlie more than 40 genetic diseases, which typically lead to neurological and neuromuscular problems. The C9orf72 hexanucleotide repeat expansion has been identified as a cause for both amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD). Normal C9orf72 contains up to 25 repeats, whereas those in afflicted individuals can have thousands. This study suggests that a gain in RNA toxicity underlies C9orf72-linked pathology in ALS/FTD. Transcribed C9orf72 hexanucleotide repeats are shown to bind to specific ribonucleoproteins, such as nucleolin, in a conformation-dependent manner; as a result nucleolin is mislocalized and functionally impaired, leading to nucleolar stress.

Transgenic overexpression of Cu(+2)/Zn(+2) superoxide dismutase 1 (SOD1) harboring an amyotrophic lateral sclerosis (ALS)-linked familial genetic mutation (SOD1(G93A)) in a Sprague-Dawley rat results in ALS-like motor neuron disease. Motor neuron disease in these rats depended on high levels of mutant SOD1 expression, increasing from 8-fold over endogenous SOD1 in the spinal cord of young presymptomatic rats to 16-fold in end-stage animals. Disease onset in these rats was early, approximately 115 days, and disease progression was very rapid thereafter with affected rats reaching end stage on average within 11 days. Pathological abnormalities included vacuoles initially in the lumbar spinal cord and subsequently in more cervical areas, along with inclusion bodies that stained for SOD1, Hsp70, neurofilaments, and ubiquitin. Vacuolization and gliosis were evident before clinical onset of disease and before motor neuron death in the spinal cord and brainstem. Focal loss of the EAAT2 glutamate transporter in the ventral horn of the spinal cord coincided with gliosis, but appeared before motor neuron/axon degeneration. At end-stage disease, gliosis increased and EAAT2 loss in the ventral horn exceeded 90%, suggesting a role for this protein in the events leading to cell death in ALS. These transgenic rats provide a valuable resource to pursue experimentation and therapeutic development, currently difficult or impossible to perform with existing ALS transgenic mice.

Reactive astrocytes are thought to protect the penumbra during brain ischemia, but direct evidence has been lacking due to the absence of suitable experimental models. Previously, we generated mice deficient in two intermediate filament (IF) proteins, glial fibrillary acidic protein (GFAP) and vimentin, whose upregulation is the hallmark of reactive astrocytes. GFAP −/− Vim −/− mice exhibit attenuated posttraumatic reactive gliosis, improved integration of neural grafts, and posttraumatic regeneration. Seven days after middle cerebral artery (MCA) transection, infarct volume was 210 to 350% higher in GFAP −/− Vim −/− than in wild-type (WT) mice; GFAP −/− , Vim −/− and WT mice had the same infarct volume. Endothelin B receptor (ET B R) immunoreactivity was strong on cultured astrocytes and reactive astrocytes around infarct in WT mice but undetectable in GFAP −/− Vim −/− astrocytes. In WT astrocytes, ET B R colocalized extensively with bundles of IFs. GFAP −/− Vim −/− astrocytes showed attenuated endothelin-3-induced blockage of gap junctions. Total and glutamate transporter-1 (GLT-1)-mediated glutamate transport was lower in GFAP −/− Vim −/− than in WT mice. DNA array analysis and quantitative real-time PCR showed downregulation of plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), an inhibitor of tissue plasminogen activator. Thus, reactive astrocytes have a protective role in brain ischemia, and the absence of astrocyte IFs is linked to changes in glutamate transport, ET B R-mediated control of gap junctions, and PAI-1 expression.

Recent work has suggested a role for astrocyte dysfunction in the etiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) caused by mutations in superoxide dismutase (SOD1). Lepore et al. show here that transplantation of astrocyte-restricted progenitors in fact improves survival of rats expressing a human ALS-associated SOD1 allele. The rescue effect required the astrocytic glutamate transporter GLT1. Cellular abnormalities in amyotrophic lateral sclerosis (ALS) are not limited to motor neurons. Astrocyte dysfunction also occurs in human ALS and transgenic rodents expressing mutant human SOD1 protein (SOD1G93A). Here we investigated focal enrichment of normal astrocytes using transplantation of lineage-restricted astrocyte precursors, called glial-restricted precursors (GRPs). We transplanted GRPs around cervical spinal cord respiratory motor neuron pools, the principal cells whose dysfunction precipitates death in ALS. GRPs survived in diseased tissue, differentiated efficiently into astrocytes and reduced microgliosis in the cervical spinal cords of SOD1G93A rats. GRPs also extended survival and disease duration, attenuated motor neuron loss and slowed declines in forelimb motor and respiratory physiological functions. Neuroprotection was mediated in part by the primary astrocyte glutamate transporter GLT1. These findings indicate the feasibility and efficacy of transplantation-based astrocyte replacement and show that targeted multisegmental cell delivery to the cervical spinal cord is a promising therapeutic strategy for slowing focal motor neuron loss associated with ALS.

Tofersen is an antisense oligonucleotide that mediates the degradation of superoxide dismutase 1 (SOD1) messenger RNA to reduce SOD1 protein synthesis. Intrathecal administration of tofersen is being studied for the treatment of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) due to SOD1 mutations.We conducted a phase 1-2 ascending-dose trial evaluating tofersen in adults with ALS due to SOD1 mutations. In each dose cohort (20, 40, 60, or 100 mg), participants were randomly assigned in a 3:1 ratio to receive five doses of tofersen or placebo, administered intrathecally for 12 weeks. The primary outcomes were safety and pharmacokinetics. The secondary outcome was the change from baseline in the cerebrospinal fluid (CSF) SOD1 concentration at day 85. Clinical function and vital capacity were measured.A total of 50 participants underwent randomization and were included in the analyses; 48 participants received all five planned doses. Lumbar puncture-related adverse events were observed in most participants. Elevations in CSF white-cell count and protein were reported as adverse events in 4 and 5 participants, respectively, who received tofersen. Among participants who received tofersen, one died from pulmonary embolus on day 137, and one from respiratory failure on day 152; one participant in the placebo group died from respiratory failure on day 52. The difference at day 85 in the change from baseline in the CSF SOD1 concentration between the tofersen groups and the placebo group was 2 percentage points (95% confidence interval [CI], -18 to 27) for the 20-mg dose, -25 percentage points (95% CI, -40 to -5) for the 40-mg dose, -19 percentage points (95% CI, -35 to 2) for the 60-mg dose, and -33 percentage points (95% CI, -47 to -16) for the 100-mg dose.In adults with ALS due to SOD1 mutations, CSF SOD1 concentrations decreased at the highest concentration of tofersen administered intrathecally over a period of 12 weeks. CSF pleocytosis occurred in some participants receiving tofersen. Lumbar puncture-related adverse events were observed in most participants. (Funded by Biogen; ClinicalTrials.gov number, NCT02623699; EudraCT number, 2015-004098-33.).

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)

The ability to generate human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neural cells displaying region-specific phenotypes is of particular interest for modeling central nervous system (CNS) biology in vitro. We describe a unique method by which spinal cord hiPSC-derived astrocytes (hiPSC-A) are cultured with spinal cord hiPSC-derived motor neurons (hiPSC-MN) in a multielectrode array (MEA) system to record electrophysiological activity over time. We show that hiPSC-A enhance hiPSC-MN electrophysiological maturation in a time-dependent fashion. The sequence of plating, density, and age in which hiPSC-As are co-cultured with MN, but not their respective hiPSC line origin, are factors that influence neuronal electrophysiology. When compared to co-culture with mouse primary spinal cord astrocytes, we observe an earlier and more robust electrophysiological maturation in the fully human cultures, suggesting that the human origin is relevant to the recapitulation of astrocyte/motor neuron cross-talk. Finally, we test pharmacological compounds on our MEA platform and observe changes in electrophysiological activity which confirm hiPSC-MN maturation. These findings are supported by immunocytochemistry and real time PCR studies in parallel cultures demonstrating human astrocyte mediated changes in the structural maturation and protein expression profiles of the neurons. Interestingly, this relationship is reciprocal and co-culture with neurons influences astrocyte maturation as well. Taken together these data indicate that in a human in vitro spinal cord culture system, astrocytes alter hiPSC-MN maturation in a time-dependent and species specific manner and suggest a closer approximation of in vivo conditions.

Abstract Background Spinal cord motor neurons (MNs) from human iPS cells (iPSCs) have wide applications in disease modeling and therapeutic development for amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and other MN-associated neurodegenerative diseases. We need highly efficient MN differentiation strategies for generating iPSC-derived disease models that closely recapitulate the genetic and phenotypic complexity of ALS. An important application of these models is to understand molecular mechanisms of action of FDA-approved ALS drugs that only show modest clinical efficacy. Novel mechanistic insights will help us design optimal therapeutic strategies together with predictive biomarkers to achieve better efficacy. Methods We induce efficient MN differentiation from iPSCs in 4 days using synthetic mRNAs coding two transcription factors (Ngn2 and Olig2) with phosphosite modification. These MNs after extensive characterization were applied in electrophysiological and neurotoxicity assays as well as transcriptomic analysis, to study the neuroprotective effect and molecular mechanisms of edaravone, an FDA-approved drug for ALS, for improving its clinical efficacy. Results We generate highly pure and functional mRNA-induced MNs (miMNs) from normal and ALS iPSCs, as well as embryonic stem cells. Edaravone alleviates H 2 O 2 -induced neurotoxicity and electrophysiological dysfunction in miMNs, demonstrating its neuroprotective effect that was also found in the glutamate-induced miMN neurotoxicity model. Guided by the transcriptomic analysis, we show a previously unrecognized effect of edaravone to induce the GDNF receptor RET and the GDNF/RET neurotrophic signaling in vitro and in vivo , suggesting a clinically translatable strategy to activate this key neuroprotective signaling. Notably, edaravone can replace required neurotrophic factors (BDNF and GDNF) to support long-term miMN survival and maturation, further supporting the neurotrophic function of edaravone-activated signaling. Furthermore, we show that edaravone and GDNF combined treatment more effectively protects miMNs from H 2 O 2 -induced neurotoxicity than single treatment, suggesting a potential combination strategy for ALS treatment. Conclusions This study provides methodology to facilitate iPSC differentiation and disease modeling. Our discoveries will facilitate the development of optimal edaravone-based therapies for ALS and potentially other neurodegenerative diseases. Graphic Abstract

Neural stem cells (NSCs) persist throughout life in the subventricular zone (SVZ) niche of the lateral ventricles as B1 cells. Maintaining this population of NSCs depends on the balance between quiescence and self-renewing or self-depleting proliferation. Interactions between B1 cells and the surrounding niche are important in regulating this balance, but the mechanisms governing these processes have not been fully elucidated in adult mammals. The cytoplasmic FMRP-interacting protein (CYFIP1) regulates apical-basal polarity in the embryonic brain. Loss of Cyfip1 during embryonic development in mice disrupts the embryonic niche and affects cortical neurogenesis. However, a direct role for Cyfip1 in the regulation of adult NSCs has not been established. Here, we demonstrate that Cyfip1 expression is preferentially localized to B1 cells in the adult SVZ. Loss of Cyfip1 in the embryonic mouse brain results in altered adult SVZ architecture and expansion of the adult B1 cell population at the ventricular surface. Furthermore, acute deletion of Cyfip1 in adult NSCs results in a rapid change in adherens junction proteins as well as increased proliferation and the number of B1 cells at the ventricular surface. Together, these data indicate that CYFIP1 plays a critical role in the formation and maintenance of the adult SVZ niche and, furthermore, deletion of Cyfip1 unleashes the capacity of adult B1 cells for symmetric renewal to increase the adult NSC pool.

Connexin 43 (Cx43) gap junctions and hemichannels mediate astrocyte intercellular communication in the central nervous system under normal conditions and may contribute to astrocyte-mediated neurotoxicity in amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we show that astrocyte-specific knockout of Cx43 in a mouse model of ALS slows disease progression both spatially and temporally, provides motor neuron (MN) protection, and improves survival. In human ALS tissues and biofluids, we observe that higher levels of Cx43 correlate with accelerated disease progression. Using human iPSC-derived astrocytes (hiPSC-A) from both familial and sporadic ALS, we show that Cx43 is upregulated and that Cx43-hemichannels are enriched at the astrocyte membrane. We then demonstrate that the pharmacological blockade of Cx43-hemichannels in ALS astrocytes, during a specific temporal window, provides neuroprotection of hiPSC-MN and reduces ALS astrocyte-mediated neuronal hyperexcitability. Our data identify Cx43 hemichannels as novel conduits of astrocyte-mediated disease progression and a pharmacological target for disease-modifying ALS therapies.