Endproduct toxicity is a key bottleneck for biofuel/biochemical production. Biosynthesis of high-value derivatives that can easily separate would alleviate such toxicity and thus enhance bioproduction efficiency. As a proof of principle, biosynthesis (along with in-line extractive recovery) of fatty acid esters using clostridia was investigated in this study. We hypothesize that solventogenic clostridia are excellent platforms for ester production, because they co-produce acyl-CoAs (acetyl-CoA and butyryl-CoA), acids (acetate and butyrate), and alcohols (ethanol and butanol). Through rational screening for host strains and genes (encoding alcohol acyl transferases and lipase), systematic metabolic engineering, and elimination of putative prophages, we obtained strains that can produce 20.3 g/L butyl acetate and 1.6 g/L butyl butyrate respectively, which were both historically highest levels in microbial hosts. Our principle for engineering microorganisms to produce high-value and easy-recoverable endproducts is highly applicable to other bioprocesses, and could lead to breakthroughs in biofuel/biochemical production and general bioeconomy.

Abstract The plant-sourced polyketide triacetic acid lactone (TAL) has been recognized as a promising platform chemical for the biorefinery industry. However, its practical application was rather limited due to low natural abundance and inefficient cell factories for biosynthesis. Here we report the metabolic engineering of oleaginous yeast Rhodotorula toruloides for TAL overproduction. We first introduced a 2-pyrone synthase gene from Gerbera hybrida ( GhPS ) into R. toruloides and investigated the effects of different carbon sources on TAL production. We then systematically employed a variety of metabolic engineering strategies to increase the flux of acetyl-CoA by enhancing its biosynthetic pathways and disrupting its competing pathways. We found that overexpression of citrate lyase (ACL1) improved TAL production by 45% compared to the GhPS overexpressing strain, and additional overexpression of acetyl-CoA carboxylase (ACC1) further increased TAL production by 29%. Finally, we characterized the resulting strain I12- ACL1-ACC1 using fed-batch bioreactor fermentation in glucose or oilcane juice medium with acetate supplementation and achieved a titer of 28 g/L or 23 g/L TAL, respectively. This study demonstrates that R. toruloides is a promising host for production of TAL and other acetyl-CoA-derived polyketides from low-cost carbon sources. Graphical abstract Triacetic acid lactone (TAL) is a promising platform chemical. Cao et al. overexpressed 2-pyrone synthase in oleaginous yeast Rhodotorula toruloides to produce TAL. They systematically evaluated various metabolic gene targets to increase acetyl-CoA and malonyl-CoA levels for TAL production and found that overexpression of both ACL1 and ACC1 led to 28 g/L or 23 g/L of TAL from glucose or oilcane juice with acetate supplementation, respectively, in fed-batch fermentation.