Abstract The advent of single-cell RNA sequencing has provided illuminating information on complex systems. However, large numbers of genes tend to be scarcely detected in common scRNAseq approaches due to technical dropout. Although bioinformatics approaches have been developed to approximate true expression profiles, assess the dropout events on single-cell transcriptomes is still consequently challenging. In this report, we present a new plate-based method for scRNAseq that relies on Tn5 transposase to tagment cDNA following second strand synthesis. By utilizing pre-amplification tagmentation step, scSTATseq libraries are insulated against technical dropout, allowing for detailed analysis of gene-gene co-expression relationships and mapping of pathway trajectories. The entire scSTATseq library construction workflow can be completed in 7 hours, and recover transcriptome information on up to 8,000 protein-coding genes. Investigation of osteoclast differentiation using this workflow allowed us to identify novel markers of interest such as Rab15. Overall, scSTATseq is an efficient and economical method for scRNAseq that compares favorably with existing workflows.

Recent advances in bioinformatics analyses have led to the development of novel tools enabling the capture and trajectory mapping of single-cell RNA sequencing (scRNAseq) data. However, there is a lack of methods to assess the contributions of biological pathways and transcription factors to an overall developmental trajectory mapped from scRNAseq data. In this manuscript, we present a simplified approach for trajectory inference of pathway significance (TIPS) that leverages existing knowledgebases of functional pathways and transcription factor targets to enable further mechanistic insights into a biological process. TIPS returns both the key pathways whose changes are associated with the process of interest, as well as the individual genes that best reflect these changes. TIPS also provides insight into the relative timing of pathway changes, as well as a suite of visualizations to enable simplified data interpretation of scRNAseq libraries generated using a wide range of techniques. The TIPS package can be run through either a web server, or downloaded as a user-friendly GUI run in R, and may serve as a useful tool to help biologists perform deeper functional analyses and visualization of their single-cell and/or large cohort RNAseq data.

Respiratory syncytial virus (RSV) is a nonsegmented negative-strand (NNS) RNA virus and a leading cause of severe lower respiratory tract illness in infants and the elderly. Transcription of the ten RSV genes proceeds sequentially from the 3’ promoter and requires conserved gene start (GS) and gene end (GE) signals. Previous studies using the prototypical GA1 genotype Long and A2 strains have indicated a gradient of gene transcription. However, recent reports show data that appear inconsistent with a gradient. To better understand RSV transcriptional regulation, mRNA abundances from five RSV genes were measured by quantitative real-time PCR (qPCR) in three cell lines and cotton rats infected with virus isolates belonging to four different genotypes (GA1, ON, GB1, BA). Relative mRNA levels reached steady-state between four and 24 hours post-infection. Steady-state patterns were genotype-specific and non-gradient, where mRNA levels from the G (attachment) gene exceeded those from the more promoter-proximal N (nucleocapsid) gene across isolates. Transcript stabilities could not account for the non-gradient patterns observed, indicating that relative mRNA levels more strongly reflect transcription than decay. While the GS signal sequences were highly conserved, their alignment with N protein in the helical ribonucleocapsid, i.e., N-phase, was variable, suggesting polymerase recognition of GS signal conformation affects transcription initiation. The effect of GS N-phase on transcription efficiency was tested using dicistronic minigenomes. Ratios of minigenome gene expression showed a switch-like dependence on N-phase with a period of seven nucleotides. Our results indicate that RSV gene expression is in part sculpted by polymerases that initiate transcription with a probability dependent on GS signal N-phase.

Non-invasive prenatal testing (NIPT) employs ultra-low-pass sequencing of maternal plasma cell-free DNA to detect fetal trisomy. With exceptional sensitivity, specificity, and safety, NIPT has gained global adoption, exceeding ten million tests, establishing it as one of the largest human genetic resources. This resource holds immense potential for exploring population genetic variations and their correlations with phenotypes. Here, we present comprehensive methods tailored for analyzing large, low-depth NIPT genetic datasets, involving customized algorithms and software for genetic variation detection, genotype imputation, and genome-wide association analysis. Through evaluations, we demonstrate that, when integrated with appropriate probabilistic models and population-specific haplotype reference panels, accurate allele frequency estimation and high genotype imputation accuracy (0.8 to 0.9) are achievable for genetic variants with alternative allele frequencies between 0.01 and 0.05, at sequencing depths of 0.1x to 0.25x. Additionally, we attained an R-square exceeding 0.9 for estimating genetic effect sizes across various sequencing platforms. These findings establish a robust theoretical and practical foundation for leveraging NIPT data in advancing medical genetic studies, not only in realms of maternal and child health, but also for long-term health outcomes.

Precise estimation of genetic substitution patterns is critical for accurate reconstruction of pathogen phylogenies. Few studies of viral evolution account for variations of mutation rate across a single gene. This is especially true when considering evolution of segmented viruses where individual segments are short, encoding for few proteins. However, the structural and functional partitions of these proteins could provide valuable information for more accurate inference of viral evolution, due to the disparate immune selection pressure on different functional domains. Accurately reconstructed evolutionary features on specific functional domains can in turn provide biological information on viral protein and immune targets for vaccine design. In this study we developed and evaluated a structurally informed partitioning scheme that accounts for rate variation among immunogenic head and stalk domains of the surface protein hemagglutinin (HA) of influenza viruses. We evaluated the model fit and performance of four different models - HKY, SRD06 codon, HKY with a structurally informed partitioning scheme, SRD06 with a structurally informed partitioning scheme on pandemic A/H1N1pdm09, seasonal A/H1N1postpdm, A/H3N2, B-Yamagata-like and Victoria-like lineages, and two highly pathogenic avian influenza A viruses H5Nx and H7N9. Results showed that structurally informed partitioning with SRD06 performed better for all datasets with decisively statistical support. Significantly faster nucleotide substitution rates for head domain, compared to stalk domain was observed and may provide insight for stalk derived broadly-reactive vaccine design. Taken together, integrating a functionally informed partitioning scheme based on protein structures of immune targets allows for significant improvement of phylogenetic analysis and providing important biological insights.

ABSTRACT Wild birds can carry avian influenza viruses (AIV), including those with pandemic or panzootic potential, long distances. Even though AIV has a broad host range, few studies account for host diversity when estimating AIV spread. We analyzed AIV genomic sequences from North American wild birds, including 303 newly sequenced isolates, to estimate interspecies transmission and geographic diffusion patterns among multiple co-circulating subtypes. Our results show high transition rates within Anseriformes and Charadriiformes, but limited transitions between these orders. Patterns of interspecies transmission were positively associated with breeding habitat range overlap, and negatively associated with host genetic distance. Distance between regions (negative correlation) and summer temperature at origin (positive correlation) were strong predictors of diffusion. Taken together, this study demonstrates that host diversity and ecology can determine evolutionary processes that underlie AIV natural history and spread. Understanding these processes can provide important insights for effective control of AIV.