ABSTRACT Most of the biosynthetic gene clusters (BGCs) found in filamentous fungi are silent under standard laboratory cultivation conditions due to the lack of expression triggering stimuli, representing a considerable drawback in drug discovery. To access the full biosynthetic potential of these microbes, studies towards the activation of cryptic BGCs are essential. Histone acetylation status is an important regulator of chromatin structure which impacts in cell physiology and, therefore, expression of biosynthetic gene clusters in filamentous fungi. Histone deacetylases (HDACs) and histone acetyl-transferases (HATs) are responsible for maintaining and controlling this process under different cell conditions. In this study, clr3 , a gene encoding a histone deacetylase in Penicillium brasilianum was deleted and associated phenotypic and metabolic changes evaluated. Results indicate reduced growth under oxidative stress conditions in the Δ clr3 knockout strain. Also, the production of several secondary metabolites including austin-related meroterpenoids, brasiliamides, mycotoxins such as verruculogen and penicillic acid, as well as cyclodepsipeptides was reduced in the Δ clr3 strain when compared to wild-type strain. Accordingly, addition of epigenetic modulators responsible for HDAC inhibition such as suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) and nicotinamide (NAA) to P. brasilianum growth media also culminated in reduction of secondary metabolite production. Mass Spectrometry Imaging (MSI) was applied to compare metabolite production and spatial distribution on the colony. Results suggest that Clr3 plays an important role in secondary metabolite biosynthesis in P. brasilianum , thus offering new strategies for regulation of natural product synthesis by assessing chromatin modification in P. brasilianum .

Abstract Aspergillus fumigatus is a major opportunistic fungal pathogen of immunocompromised and immunocompetent hosts. To successfully establish an infection, A. fumigatus needs to use host carbon sources, such as acetate, present in the body fluids and peripheral tissues. However, utilisation of acetate as a carbon source by fungi in the context of infection has not been investigated. This work shows that acetate is metabolised via different pathways in A. fumigatus and that acetate utilisation is under the regulatory control of a transcription factor (TF), FacB. A. fumigatus acetate utilisation is subject to carbon catabolite repression (CCR), although this is only partially dependent on the TF and main regulator of CCR CreA. The available extracellular carbon source, in this case glucose and acetate, significantly affected A. fumigatus virulence traits such as secondary metabolite secretion and cell wall composition, with the latter having consequences for resistance to oxidative stress, to anti-fungal drugs and to human neutrophil-mediated killing. Furthermore, deletion of facB significantly impaired the in vivo virulence of A. fumigatus in both insect and mammalian models of invasive aspergillosis. This is the first report on acetate utilisation in A. fumigatus and this work further highlights the importance of available host-specific carbon sources in shaping fungal virulence traits and subsequent disease outcome, and a potential target for the development of anti-fungal strategies. Importance Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen in humans. During infection, A. fumigatus is predicted to use host carbon sources, such as acetate, present in body fluids and peripheral tissues, to sustain growth and promote colonisation and invasion. This work shows that A. fumigatus metabolises acetate via different pathways, a process that is dependent on the transcription factor FacB. Furthermore, the type and concentration of the extracellular available carbon source were determined to shape A. fumigatus virulence determinants such as secondary metabolite secretion and cell wall composition. Subsequently, interactions with immune cells are altered in a carbon source-specific manner. FacB is required for A. fumigatus in vivo virulence in both insect and mammalian models of invasive aspergillosis. This is the first report that characterises acetate utilisation in A. fumigatus and highlights the importance of available host-specific carbon sources in shaping virulence traits and potentially subsequent disease outcome.

Abstract Aspergillus fumigatus is the main causative agent of invasive pulmonary aspergillosis (IPA), a severe disease that affects immunosuppressed patients worldwide. The fungistatic drug caspofungin is the second line therapy against IPA but has increasingly been used against clinical strains that are resistant to azoles, the first line antifungal therapy. In high concentrations, caspofungin induces a tolerance phenotype with partial reestablishment of fungal growth called caspofungin paradoxical effect (CPE), resulting from a change in the composition of the cell wall. An increasing number of studies has shown that different isolates of A. fumigatus exhibit phenotypic heterogeneity, including heterogeneity in their CPE response. To gain insights into the underlying molecular mechanisms of CPE response heterogeneity, we analyzed the transcriptomes of two A. fumigatus reference strains, Af293 and CEA17, exposed to low and high caspofungin concentrations. We found that there is a core transcriptional response that involves genes related to cell wall remodeling processes, mitochondrial function, transmembrane transport, and amino acid and ergosterol metabolism, and a variable response related to secondary metabolite (SM) biosynthesis and iron homeostasis. Specifically, we show here that the overexpression of a SM pathway that works as an iron chelator extinguishes the CPE in both backgrounds, whereas iron depletion is detrimental for the CPE in Af293 but not in CEA17. We next investigated the function of the transcription factor CrzA, whose deletion was previously shown to result in heterogeneity in the CPE response of the Af293 and CEA17 strains. We found that CrzA constitutively binds to and modulates the expression of several genes related to processes involved in caspofungin tolerance, and that crzA deletion differentially impacts the SM production and growth of Af293 and CEA17. As opposed to the Δ crzA CEA17 mutant, the Δ crzA Af293 mutant fails to activate cell wall remodeling genes upon caspofungin exposure, which most likely severely affects its macrostructure and extinguishes its CPE. This work describes how heterogeneity in the response to an antifungal agent between A. fumigatus strains stems from heterogeneity in the function of a transcription factor and its downstream target genes.

ABSTRACT Penicillium digitatum is the most aggressive pathogen of citrus fruits. Tryptoquialanines are major indole alkaloids produced by P. digitatum . It is unknown if tryptoquialanines are involved in the damage of citrus fruits caused by P. digitatum . To investigate the pathogenic roles of tryptoquialanines, we initially asked if tryptoquialanines could affect the germination of Citrus sinensis seeds. Exposure of the citrus seeds to tryptoquialanine A resulted in a complete inhibition of germination and an altered metabolic response. Since this phytotoxic effect requires the extracellular export of tryptoquialanine A, we investigated the mechanisms of extracellular delivery of this alkaloid in P. digitatum . We detected extracellular vesicles (EVs) released by P. digitatum both in culture and during infection of citrus fruits. Compositional analysis of EVs produced during infection revealed the presence of a complex cargo, which included tryptoquialanines and the mycotoxin fungisporin. The EVs also presented phytotoxicity activity in vitro , and caused damage to the tissues of citrus seeds. Through molecular networking, it was observed that the metabolites present in the P. digitatum EVs are produced in all of its possible hosts. Our results reveal a novel phytopathogenic role of P. digitatum EVs and tryptoquialanine A, implying that this alkaloid is exported in EVs during plant infection. IMPORTANCE During the post-harvest period, citrus fruits can be affected by phytopathogens such as Penicillium digitatum , which causes the green mold disease and is responsible for up to 90 % of the total citrus losses. Chemical fungicides are widely used to prevent the green mold disease, leading to concerns about environmental and health risks. To develop safer alternatives to control phytopathogens, it is necessary to understand the molecular basis of infection during the host-pathogen interaction. In the P. digitatum model, the virulence strategies are poorly known. Here, we describe the production of phytotoxic extracellular vesicles (EVs) by P. digitatum during the infection of citrus fruits. We also characterized the secondary metabolites in the cargo of EVs and found in this set of molecules an inhibitor of seed germination. Since EVs and secondary metabolites have been related to virulence mechanisms in other host-pathogen interactions, our data are important for the comprehension of how P. digitatum causes damage to its primary hosts.

Abstract The small molecule (molecular mass < 900 Daltons) composition of extracellular vesicles (EVs) produced by the pathogenic fungus Cryptococcus gattii is unknown, which limits the understanding of the functions of cryptococcal EVs. In this study, we analyzed the composition of small molecules in samples obtained from solid cultures of C. gattii by a combination of chromatographic and spectrometric approaches, and untargeted metabolomics. This analysis revealed previously unknown components of EVs, including small peptides with known biological functions in other models. The peptides found in C. gattii EVs had their chemical structure validated by chemical approaches and comparison with authentic standards, and their functions tested in a Galleria mellonella model of cryptococcal infection. One of the vesicular peptides (isoleucine-proline-isoleucine, Ile-Pro-Ile) improved the survival of G. mellonella lethally infected with C. gattii or C. neoformans . These results indicate that small molecules exported in EVs are biologically active in Cryptococcus. Our study is the first to characterize a fungal EV molecule inducing protection, pointing to an immunological potential of extracellular peptides produced by C. gattii .

O jogo clássico da Torre de Hanoi (ToH) consiste em uma base com três pinos P = p0, p1, p2 e um conjunto de n discos D = {d1, d2, ..., dn} de diferentes tamanhos, sendo di < dj se i < j. No estado inicial todos os discos estão empilhados em p0 em ordem decrescente de tamanho, um estado regular perfeito. O objetivo do jogo é transferir todos os discos para p2, nessa mesma disposição, obedecendo-se as seguintes regras: (1) pode-se mover apenas um disco de cada vez, e sempre o disco do topo de um dos pinos; (2) o disco di só pode ser colocado sobre dj se i < j. Denota-se Hn o grafo da ToH com n discos. Hn caracteriza todos os estados regulares possíveis e os movimentos que podem ser feitos de um estado para outro. Neste trabalho é apresentado um algoritmo recursivo que, partindo do case base H1 e de um ciclo C6, gera o grafo da ToH para qualquer número de discos (Hn).

Abstract Understanding extremophiles and their usefulness in biotechnology involves studying their habitat, physiology and biochemical adaptations, as well as their ability to produce biocatalysts, in environments that are still poorly explored. In northwestern Peru, which has saline lagoons of marine origin Pacific Ocean, the other site is from the coast of Brazil of the Atlantic Ocean. Both environments are considered extreme. The objective of the present work was to compare two different strains isolated from these extreme environments at the metabolic level using molecular network methodology through the Global Natural Products Molecular Social Network (GNPS). In our study, the MS/MS spectra from the network were compared with GNPS spectral libraries, where the metabolites were annotated. Differences were observed in the molecular network presented in the two strains of Streptomyces spp. coming from these two different environments. Within the an-notated compounds from marine bacteria, the metabolites characterized for Streptomyces sp. B-81 from Peruvian marshes were lobophorins A (1) and H (2), as well as divergolides A (3), B (4) and C (5). Streptomyces sp. 796.1 produced different compounds, such as glucopiericidin A (6) and dehy-dro-piericidin A1a (7). The search for new metabolites in underexplored environments may therefore reveal new metabolites with potential application in different areas of biotechnology.

Abstract Antibiotics are essential for modern medicine, but their use drives the evolution of antimicrobial resistance (AMR) that limits the long-term efficacy of any one drug. To keep pace with AMR and preserve our ability to treat bacterial infections, it is essential that we identify antibiotics with new structures and targets that are not affected by clinical resistance. Historically, most developmental candidates for antibiotics have come from microbial natural products, as they feature chemical structures and biological activities that have been honed over millions of years of evolution. Unfortunately, as classical bioactivity screens for natural product discovery are blind to the pharmacological properties of their hits, they often identify molecules with functional groups that limit their utility as drugs. One prominent example is actinonin, an inhibitor of bacterial peptide deformylase (PDF) whose activity is dependent on a hydroxamate moiety associated with toxicity in vivo . The abundance of bacterial genomes now presents an opportunity for target-based natural product discovery, where biosynthetic pathways can be mined for molecules that possess desired activities but lack toxic moieties. Here, we use bioinformatics to lead a chemotype-sensitive, target-based search for natural product inhibitors of bacterial PDF that lacks the conserved and problematic metal chelating group. We describe the discovery, heterologous expression, biosynthesis, total synthesis, and activity of the molecule gammanonin: an apparent actinonin homologue from Gammaproteobacteria. Moving forward, we hope this chemotype and target-driven methodology will help to expedite the discovery of new leads for antibiotic development.

Abstract The unexplored saline lagoons of the north of Peru harbor a rich microbiome, due to reported studies of different extreme environments around the world. In these regions, there are several ecosystems and microhabitats not yet explored, and little is known about the diversity of actinobacteria and other microorganisms. We suggest that the endemic bacteria present in this extreme environment could be source of active molecules with anticancer, antimicrobial, antiparasitic properties. Using phenotypic and genotypic characterization techniques including the 16S rRNA were identified into the genera Streptomyces 39 (78%), Pseudonocardia 3 (6%), Staphylococcus 4 (8%), Bacillus 2 (4%), and Pseudomonas 2 (4%). All isolated bacteria for the genotypic data were preliminarily identified. Actinobacteria strains were found dominantly in both sites (Lagoon1-3 = 16 isolates and lagoon 4 = 12 isolates). Phylogenetic analysis revealed that 28 isolates were exclusively affiliated to eleven different clusters of Actinobacteria of the major genus Streptomyces . Three Streptomyces sp. strains M-92, B-146, and B-81, were tested for antibacterial and antiproliferative activities. The results showed antiproliferative activities against three tumor cell lines, U251 glioma; MCF7 breast; NCI-H460 lung non-small type of cells, and the antibacterial activity to Staphylococcus aureus ATCC 6538, E. coli ATCC 10536, and Acinetobacter baumanni AC-972 which is resistant to multiple drugs. The promising results belong to Streptomyces sp. B-81 strain in the R2A medium using a doxorubicin with control positive, the best result was from the latter (TGI = 0,57 µg/mL) for glioma; NCI-H460 lung of type non-small cells (TGI = 0,61 µg/mL), and breast cancer (TGI =0,80 µg/mL), this strain was selected to be fractionated because it had better antiproliferative and antibacterial activity, and its fractions were evaluated concerning antiproliferative activity against nine types of tumor cells and one non-tumor. The methanolic fraction showed a better result in the antiproliferative activity and was able to inhibit U251 (glioma) (TGI = 38.3 µg/mL), OVCAR-03 (ovary) (TGI = 62.1 µg/mL), and K562 (leukemia) (TGI = 81.5 µg/mL). The methanol 50% - acetate 50% fraction (Fraction 4) inhibited U251 (glioma) (TGI = 73.5 µg/mL) and UACC-62 (melanoma) (TGI = 89.4 µg/mL). Moreover, the UHPLC-MS/MS data and molecular networking of Streptomyces sp . B-81 isolate extract revealed the production cholic acid, Lobophorin A, Lobophorin B, Lobophorin E, Lobophorin K and compound 6. Extremophilic environments such as the Mórrope and Bayovar Salt Flats are promising sources of new bacteria with promising pharmaceutical potential; These compounds could be useful to treat various infectious diseases or even some type of cancer.